照射诱导自噬对三阴性乳腺癌中PD-L1介导免疫抑制的影响.pdf
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1、林春香,韦可璇,宋秋露,等.照射诱导自噬对三阴性乳腺癌中P D L 1介导免疫抑制的影响收稿日期:2 0 2 2 1 0 1 5 修回日期:2 0 2 2 1 1 2 6*广西自然科学基金项目(2 0 1 7 J J A 1 0 7 4 8),广西医疗卫生适宜技术开发与推广应用项目(S 2 0 1 8 0 8),广西高校生物分子医学研究重点实验室开放课题项目(G X BMR 2 0 1 6 0 4),南宁市武鸣区科学研究与技术开发计划项目(2 0 2 0 0 2 1 3),广西壮族自治区卫生健康委员会西医类别自筹经费科研课题(Z 2 0 2 0 1 3 1 1)和南宁市武鸣区重点研发计划项目(
2、2 0 2 1 0 1 2 4)资助。【第一作者简介】林春香(1 9 9 6-),女,在读硕士研究生,主要从事放射肿瘤学研究。【*通信作者】赵 伟(1 9 8 1-),男,博士,副教授,主要从事放射肿瘤学研究,E m a i l:z w e i 1 1 1 21 2 6.c o m。【引用本文】林春香,韦可璇,宋秋露,等.照射诱导自噬对三阴性乳腺癌中P D L 1介导免疫抑制的影响J.广西科学,2 0 2 3,3 0(3):6 0 5 6 1 3.L I N C X,WE I K X,S ON G Q L,e t a l.E f f e c t o f R a d i a t i o n I
3、n d u c e d A u t o p h a g y o n P D L 1 M e d i a t e d I mm u n o s u p p r e s s i o n i n T r i p l e N e g a t i v e B r e a s t C a n c e r J.G u a n g x i S c i e n c e s,2 0 2 3,3 0(3):6 0 5 6 1 3.特邀栏目照射诱导自噬对三阴性乳腺癌中P D L 1介导免疫抑制的影响*林春香,韦可璇,宋秋露,赵 伟*(广西医科大学附属武鸣医院放疗科,广西南宁 5 3 0 1 9 9)摘要:三阴性乳腺癌
4、(T r i p l e N e g a t i v e B r e a s t C a n c e r,T N B C)中外泌体(E x o s o m e s)携带的细胞程序性死亡配体1(P r o g r a mm e d C e l l D e a t h L i g a n d 1,P D L 1)与肿瘤微环境(T u m o r M i c r o e n v i r o n m e n t,TME)免疫抑制相关。为探讨照射能否调节P D L 1的表达从而改善TME的作用,本研究首先通过R T q P C R和W e s t e r n b l o t检测自噬抑制剂氯喹(C h l
5、 o r o q u i n e,C Q)、自噬激活剂雷帕霉素(R a p a m y c i n,R a p a)及蛋白酶体抑制剂MG 1 3 2在联合或不联合照射下P D L 1、L C 3 B和P 6 2蛋白的表达情况;其次,采用细胞免疫荧光检测照射前后P D L 1的表达及定位改变;再次,采用W e s t e r n b l o t检测照射前后外泌体中P D L 1(s E V s P D L 1)的表达;最后,采用生物信息学对A T G 7与乳腺癌预后、信号通路的相关性进行分析。结果显示:P D L 1在T N B C中的表达高于非三阴性乳腺癌(n o n T N B C);P D
6、 L 1可通过自噬溶酶体降解,照射后诱导自噬可以促进P D L 1的胞浆转移及下调s E V s P D L 1的表达,具体机制可能与信号转导和转录激活因子3(S i g n a l T r a n s d u c e r a n d A c t i v a t o r o f T r a n s c r i p t i o n 3,S T AT 3)的激活及外泌体转运相关。上述结果说明照射可以通过影响自噬及外泌体的发生,使P D L 1在微环境中表达下调,进而调控肿瘤介导的免疫抑制。关键词:照射;外泌体;自噬;P D L 1;免疫调控中图分类号:R 7 3 7.9 文献标识码:A 文章编号:
7、1 0 0 5 9 1 6 4(2 0 2 3)0 3 0 6 0 5 0 9D O I:1 0.1 3 6 5 6/j.c n k i.g x k x.2 0 2 3 0 5 2 3.0 0 1 三阴性乳腺癌(T r i p l e N e g a t i v e B r e a s t C a n c e r,T N B C)是一种特殊亚型的乳腺癌,其 雌激素受 体(E s t r o g e n R e c e p t o r,E R)、孕激素受体(P r o g e s t e r o n e R e c e p t o r,P R)和原癌基因HE R 2均为阴性,极易发生远处转移和复
8、发。T N B C进展快、预后差且缺少特异性治疗手段,因此免疫治疗是T N B C探索的方向之一。长期以来乳腺癌一直被认为是免疫学上的一种“冷”肿瘤,但是与其他亚型的乳腺癌相比,T N B C506广西科学,2 0 2 3年,3 0卷,第3期 G u a n g x i S c i e n c e s,2 0 2 3,V o l.3 0 N o.3免疫原性更强1 3,提示免疫治疗已成为T N B C治疗新的希望。但实际上T N B C免疫检查点抑制剂单药治疗反应率不高,其中的原因尚未明确。信号转导和转录激活因子3(S i g n a l T r a n s d u c e r a n d A
9、c t i v a t o r o f T r a n s c r i p t i o n 3,S T AT 3)的过度表达4、外泌体(E x o s o m e s)携带的细胞程序性死亡配体1(P r o g r a mm e d C e l l D e a t h L i g a n d 1,P D L 1)抑制肿瘤微环境5(T u m o r M i c r o e n v i r o n m e n t,TME)可能是T N B C免疫检查点抑制剂单药治疗效果差的原因。激活的S T AT 3不仅与肿瘤增殖、血管生成和转移有关,还能促进免疫抑制因子的表达,同时阻碍T h 1细胞6,7分泌
10、细胞因子从而抑制T N B C的肿瘤微环境。肿瘤细胞分泌的外泌体富含免疫抑制蛋白,如P D L 1,其能使免疫细胞失活,并进一步阻止免疫细胞识别和杀伤肿瘤细胞8,9。目前,尚无靶向调控P D L 1转运、S T AT 3降解并诱导TME重塑的方法。放射治疗是包括乳腺癌在内多种恶性肿瘤治疗的三大治疗手段之一,对恶性肿瘤细胞有直接杀伤作用,对TME的组成部分也有至关重要的影响。以往的研究认为放射治疗具有免疫抑制作用1 0,包括较大的单组分辐射剂量(1 5-2 0 G y)可能会永久地减少血流1 1;放射治疗会引起免疫抑制相关分子(如肿瘤坏死因子、白细胞介素1、白细胞介素6、白细胞介素1 0和转化生
11、长因子1 2,1 3)及细胞(如肿瘤相关巨噬细胞1 4、髓系抑制细胞和调节性T细胞)的聚集增多,同时引起淋巴细胞亚群损伤和功能受到抑制1 5。然而目前更多的研究认为放射治疗可以增强肿瘤细胞和TME的免疫敏感性,刺激肿瘤中更多的免疫细胞浸润和活化1 6 1 8。另外,照射可以诱导自噬的发生,细胞自噬与肿瘤的发生发展关系密切,并且自噬溶酶体途径参与了多种物质的转运1 9,2 0,但是细胞自噬调控P D L 1转运及与调节S T AT 3的机制尚未明确。本研究利用照射诱导肿瘤细胞发生自噬,探讨自噬对P D L 1和S T AT 3溶酶体降解的影响,为改善肿瘤微环境的免疫抑制及T B N C治疗提供一
12、个新策略。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 细胞与慢病毒载体 人乳腺癌细胞T N B C细胞株(MD A MB 2 3 1、B T 5 4 9)、非 三 阴 性 乳 腺 癌(n o n T N B C)细 胞 株(MC F 7、B T 4 7 4)及J u r k a t购自武汉普诺赛生命科技有限公司。根据A T G 7基因(G e n e I D:1 0 5 3 3)设计的重组慢病毒敲低载体s h A T G 7和空载体v e c t o r(阴性对照)购自上海吉凯基因医学科技股份有限公司。1.1.2 主要材料与试剂 自噬激活剂雷帕霉素(R a p a m y c i n,R a p a
13、)购自美国S i g m a公司,自噬抑制剂氯喹(C h l o r o q u i n e,C Q)及蛋白酶体抑制剂MG 1 3 2、外泌体抑制剂GW 4 8 6 9购自M e d C h e m E x p r e s s,抗体L C 3 B、P 6 2、P D L 1购自美国A b c a m公司,E c a d h e r i n、V i m e n t i n购自赛信通(上海)生物试剂有限公司。GA P DH抗体、山羊抗兔l g G(H+L)和驴抗兔l g G(H+L)均购自上海碧云天生物技术有限公司,a c t i n购自圣克鲁斯生物技术(上海)有限公司,B C A蛋白定量试剂盒、
14、R I P A裂解液购自上海碧云天生物技术有限公司,杜尔贝科改良伊格尔培养基(D u i b e c c o s M o d i f i e d E a g l e M e d i-u m,DMEM)、1 6 4 0培养基、胎牛血清(F B S)购自美国G I B C O公司,青霉素、链霉素混合液和P B S缓冲液购自北京索莱宝科技有限公司,增强型化学发光(E C L)试剂盒(货号3 4 5 7 7)购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司。1.2 方法1.2.1 细胞培养 乳腺癌细胞培养于含1 0%胎牛血清、1%青霉素和链霉素混合液的DMEM,置于3 7、5%C O2的培养箱中,取对数生长期细胞用
15、于后续研究。雷帕霉素的浓度为2 0 n m o l/L,氯喹的浓度为2 5 m o l/L,MG 1 3 2的浓度为5 mm o l/L,GW 4 8 6 9的浓度为2 0 m o l/L。在 照 射 前6 h加 入 以 上 浓 度 的 药 物,MG 1 3 2在预定的实验终点前2 h加入。照射组细胞采用直线加速器6 MV X进行照射,照射剂量为8 G y2 1,2 2,照射视野为4 0 c m4 0 c m,X射线辐射装置购自瑞典E l e k t a公司。1.2.2 慢病毒转染 选取处于对数生长期的MD A MB 2 3 1细胞进行慢病毒转染,待细胞铺满孔的5 0%时,按照说明书将慢病毒敲
16、低载体s h AT G 7及空载慢病毒分别转染MD A MB 2 3 1细胞,经嘌呤霉素筛选后获得稳定转染的细胞株。采用W e s t e r n b l o t及R T q P C R验证转染效率。1.2.3 R T q P C R检测mR NA表达 使用T R I Z O L法提取细胞中总R NA,并使用5P r i m e S c r i p t R T M a s t e r M i x逆转 录 成c D NA。606林春香,韦可璇,宋秋露,等.照射诱导自噬对三阴性乳腺癌中P D L 1介导免疫抑制的影响根据S Y B R G r e e n q P C R M a s t e r M
17、 i x说明书步骤进行R T q P C R检测。1.2.4 W e s t e r n b l o t检测蛋白表达 用R I P A液裂解各组细胞,离心收集蛋白,测定蛋白浓度,用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(S D S P AG E)分离蛋白,将蛋白转移到P V D F膜上,T B S T缓冲液洗膜3次,室温封闭2 0 m i n,分别加入一抗P 6 2、L C 3 B(均12 0 0 0稀释),P D L 1、E c a d-h e r i n、V i m e n t i n、a c t i n、GA P DH(均11 0 0 0稀释),4 孵育过夜,加入二抗(11 0 0 0)室温孵
18、育 1 h,使用E C L显色。1.2.5 免疫荧光检测蛋白表达 弃去培养基,用P B S缓冲液洗涤细胞3次,加入4%多聚甲醛固定细胞 1 5 m i n,再用P B S缓冲液洗涤3次,用免疫封闭液封闭1 h。4 孵育相应一抗过夜,用P B S缓冲液洗涤3次,3 7 孵育荧光二抗1 h,再用D A P I染细胞核5 m i n。设置未照射(N C)和照射(I R,8 G y)两个处理。在E VO S F L自动显微镜下观察细胞P D L 1蛋白的绿色荧光焦点数。1.2.6 外泌体的提取与鉴定 将乳腺癌细胞MD A MB 2 3 1置于T 1 7 5培养瓶中培养,使用无外泌体完全培养基培养,当细
19、胞密度达8 0%左右时,给予8 G y X射线照射,继续培养2 4 h,然后收集细胞上清。通过差速超速离心法提取未照射(N C)与照射(I R)处理的外泌体,用透射电子显微镜观察外泌体的形态,纳米颗粒追踪分析(NT A)外泌体的粒径大小,W e s t e r n b l o t检测外泌体标志蛋白C D 6 3、T S G 1 0 1、A L I X的表达。1.2.7 生物信息学分析 通过在线数据库G E P I A(h t t p:/g e p i a.c a n c e r p k u.c n/)的s u r v i v a l模块验证自噬关键基因A T G 7与乳腺癌预后的相关性;利用数
20、据库的C o r r e l a t i o n模块对A T G 7与S T AT 1、S T AT 2、S T AT 3的关联性进行分析。1.3 统计学方法 采用G r a p h P a d p r i s m 8.0进行统计分析作图。采用单因素方差分析或独立性t检验进行数据组间分析,P0.0 5表示有统计学意义。2 结果与分析2.1 P D L 1在乳腺癌细胞中的差异表达 通过R T q P C R 图1(a)和W e s t e r n b l o t 图1(b)检测T N B C细胞株(MD A MB 2 3 1、B T 5 4 9)及n o n T N B C细胞株(MC F 7、
21、B T 4 7 4)中P D L 1的表达,结果表明,T N B C细胞株中P D L 1的mR NA和蛋白表达均高于n o n T N B C。*i n d i c a t e s P0.0 1,*i n d i c a t e s P0.0 0 1.图1 P D L 1在乳腺癌细胞中的差异表达F i g.1 D i f f e r e n t i a l e x p r e s s i o n o f P D L 1 i n b r e a s t c a n c e r c e l l s2.2 蛋白酶体和自噬溶酶体对P D L 1表达的影响 为进一步了解P D L 1降解的主要途径,使
22、用自噬抑制剂C Q、自噬激活剂R a p a及蛋白酶体抑制剂MG 1 3 2进行联合或不联合照射(I R),二甲基亚砜(DM S O)为阴性对照。W e s t e r n b l o t的结果显示,单用MG 1 3 2几乎不能上调P D L 1的表达;而单用C Q虽然可以上调P D L 1的表达,但是效果不显著 图2(a)。当联合照射时,P D L 1的表达明显提高。当使用自噬激活剂R a p a时,P D L 1的表达下调,联合照射不能使P D L 1恢复至DM S O组水平 图2:(b)(c),说明自噬溶酶体途径可能是P D L 1降解的主要途径。2.3 照射对T N B C细胞中P D
23、 L 1表达及转运的影响 免疫荧光结果显示,照射后MD A MB 2 3 1细胞的P D L 1蛋白在细胞内的荧光焦点数增多(图3)。免疫荧光结果表明照射促进了P D L 1的内吞并向胞706广西科学,2 0 2 3年,3 0卷,第3期 G u a n g x i S c i e n c e s,2 0 2 3,V o l.3 0 N o.3n s i n d i c a t e s n o s t a t i s t i c a l s i g n i f i c a n c e,*i n d i c a t e s P0.0 1,*i n d i c a t e s P0.0 0 1.图2
24、 蛋白酶体和自噬溶酶体对P D L 1表达的影响F i g.2 E f f e c t s o f p r o t e a s o m e s a n d a u t o p h a g y l y s o s o m e s o n P D L 1 e x p r e s s i o nC o m p a r e d w i t h t h e N C g r o u p,*i n d i c a t e s P0.0 5,*i n d i c a t e s P0.0 1.图3 照射对TN B C细胞中P D L 1表达及转运的影响F i g.3 E f f e c t s o f i r
25、 r a d i a t i o n o n P D L 1 e x p r e s s i o n a n d t r a n s p o r t i n T N B C c e l l内转移,即照射过程中细胞的内吞外排途径可以调节P D L 1的表达。2.4 照射对T N B C细胞中s E V s P D L 1表达的影响 为确定照射对肿瘤微环境中P D L 1的作用,通过差速超速离心法分离细胞培养上清,获得纯化的外泌体。NT A结果发现外泌体粒径大小为1 6 0 n m左右 图4:(a)(b)。透射电子显微镜下,可见有明显的膜结 构,呈 近 似 半 球 状 的 囊 泡 结 构 图4(c
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