蛹虫草退化梯度的建立及退化过程中相关分子机制的变化_张同宇.pdf
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1、现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2023,Vol.39,No.6 70 蛹虫草退化梯度的建立及退化过程中 相关分子机制的变化 张同宇1,巫迪1,马杰钊1,陈杰豪1,方玉鸿2,陈柏雄1,魏韬1*(1.华南农业大学食品学院,广东省微生态制剂工程技术研究中心,广东广州 510640)(2.江门市山海堂虫草有限公司,广东江门 529000)摘要:该研究以实验室人工栽培模拟工业生产工艺,对蛹虫草菌株 ZGCM 进行重复传代培养,人为建立了1 至7 代的菌种退化梯度株系,以探究蛹虫草退化过程中的形态变化规律及其内在分子机制的变化。实验结果表明,ZGCM
2、菌株自第 2 代开始退化,至第 6 代基本不产生子实体。培养基残糖含量随退化梯度菌种代际数目的上升而呈下降趋势,第 5 代与第 1 代相比下降了 62.40%。培养基残余蛋白质含量在第 2 代下降后出现回升,提示蛹虫草菌株随着传代次数的上升,吸收外界氮源的能力持续下降。以 qRT-PCR法测定过往报道中发现的 14 个转录水平变化趋势与蛹虫草退化代际数目呈线性相关的基因,结果表明仅有 CCM_04090 基因的表达量呈上升趋势,第 5 代与第 1 代相比提高了 39.60%,与过往报道一致。其他基因均无显著变化。以 HPLC 法测定静置液体发酵液中的虫草素含量,发现其随着传代次数的上升而下降。
3、静置发酵 30 d 时,第5 代与第1 代相比虫草素产量下降了 74.56%。结果表明蛹虫草菌株退化会对子实体产量和虫草素含量等两大产品品质核心因素造成负面影响。关键词:蛹虫草;退化梯度;虫草素;逆转录定量 PCR 文章编号:1673-9078(2023)06-70-78 DOI:10.13982/j.mfst.1673-9078.2023.6.0722 Establishment of the Cordyceps militaris Degeneration Gradient and Variations in Related Molecular Mechanisms ZHANG Tongy
4、u1,WU Di1,MA Jiezhao1,CHEN Jiehao1,FANG Yuhong2,CHEN Baixiong1,WEI Tao1*(1.College of Food Science,Research Center for Micro-Ecological Agent Engineering and Technology of Guangdong Province,South China Agricultural University,Guangzhou 510640,China)(2.Jiangmen Shanhaitang Cordyceps Co.Ltd.,Jiangmen
5、 529000,China)Abstract:Repeated subculture of the Cordyceps militaris strain ZGCM was performed in the laboratory to simulate strain degeneration during industrial cultivation.A gradually degenerated strain line was built over seven generations to explore the morphological changes and internal molec
6、ular mechanisms of degeneration.The results showed that strain ZGCM degenerates from the second generation,with no fruiting bodies observed by the sixth generation.The residual sugar in the culture medium is reduced over each generation,with sugar content decreasing by 62.40%in the fifth generation
7、as compared to the first generation.Furthermore,the residual protein content of the medium increased after the second generation,suggesting that the ability of C.militaris to absorb nitrogen from external sources declines continuously.The transcription levels of 14 differentially expressed genes tha
8、t were linearly related to C.militaris generation were measured using qRT-PCR.However,only the CCM_04090 gene showed increased expression with each generation,increasing by 39.60%in the fifth generation as compared to the first generation,which is 引文格式:张同宇,巫迪,马杰钊,等.蛹虫草退化梯度的建立及退化过程中相关分子机制的变化J.现代食品科技,
9、2023,39(6):70-78.ZHANG Tongyu,WU Di,MA Jiezhao,et al.Establishment of the Cordyceps militaris degeneration gradient and variations in related molecular mechanisms J.Modern Food Science and Technology,2023,39(6):70-78.收稿日期:2022-06-07 基金项目:广东省基础与应用基础研究基金项目(2019A1515110609);广东省教育厅科研平台项目(2020KTSCX019);江
10、门市基础与应用基础重点项目(2020030103450009103);中国博士后科学基金项目(2020M682731)作者简介:张同宇(1997-),女,硕士生,研究方向:蛹虫草基因工程,E-mail: 通讯作者:魏韬(1989-),男,博士,研究方向:蛹虫草基因工程,E-mail: 现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2023,Vol.39,No.6 71 consistent with previous reports,and no significant changes were observed for other target gene
11、s.According to the HPLC results,cordycepin production exhibited a general decline over each generation and,after 30 days of fermentation,fifth generation cordycepin production decreased by 74.56%as compared to the first generation.The results indicated that strain degeneration has a negative impact
12、on not only the production of fruiting bodies,but also on cordycepin production,both of which are core quality indicators of C.militaris products.Key words:Cordyceps militaris;degeneration gradient;cordycepin;quantitative reverse transcription polymerase chain reaction 蛹虫草(Cordyceps militaris)是一种有着长
13、久食用历史的珍贵食药用真菌,在中国及周边东南亚国家被广泛使用1。蛹虫草子实体含有丰富的虫草素、喷司他丁、虫草多糖2,3、蛋白质、虫草酸、甾醇类、核苷类化合物、类胡萝卜素以及微量元素4。其中,虫草素是蛹虫草中特有的核心生物活性物质,具有抗肿瘤、抗氧化等功效5,6。对于新冠肺炎,虫草素也有很好的抗病毒活性7。人工培育的蛹虫草中含量较高8,可以达到12.82 mg/g9,目前主要以固体发酵和液体静置发酵为主10。此外,蛹虫草所含有的虫草多糖具有免疫调节、抗肿瘤、抗氧化、抗炎等生物活性11,且蛹虫草所含的氨基酸种类包含人体所有必需氨基酸12,13。目前蛹虫草已实现人工栽培,人工栽培的蛹虫草子实体与野生
14、蛹虫草形态和有效成分一致,且培养效率高,技术难度小,投资成本低,产量高,能够代替野生蛹虫草更好地满足市场对蛹虫草日益增长的需 求14。然而,蛹虫草在人工继代培养和菌种保存过程中普遍存在退化现象,严重制约了蛹虫草产业的发展,并且带来巨大的经济损失和资源浪费15。退化的蛹虫草菌种通常表现出气生菌丝旺盛16,17、生长速度减 慢18、见光不转色19、形成黄色渗出液20、形成扇形突变区21、分生孢子产生减少、原基数量减少、菌丝和分生孢子形态发生改变、次生代谢产物含量减少等现象22。另外,蛹虫草退化菌株的纤维素酶活性、淀粉酶活性以及胞外多糖含量都低于蛹虫草正常菌株,但退化菌株的胞内多糖含量高于正常菌株1
15、8。与未退化菌株相比,退化菌株的脱色率下降、液体培养基的pH 值升高23。菌种退化是一个复杂,由多因素作用下的过程。迄今为止,蛹虫草退化这一难题尚未解决,其退化的分子机制尚不清楚。其中遗传背景是决定因素,表型变异和活性物质含量降低是菌种退化的主要表现形式18。本研究以实验室人工栽培模拟蛹虫草工业生产,建立了实验室蛹虫草品种ZGCM的1至7代梯度退化菌种库。通过测定蛹虫草在退化过程中对培养基中糖类和蛋白质类的吸收和利用能力的变化,14 种已报道与蛹虫草退化相关基因的表达水平变化,以及虫草素产量的变化,探究蛹虫草退化产生的表观现象及其内在机制,为解决蛹虫草产业中的菌种退化现象提供新的研究思路。1
16、材料与方法 1.1 原料 ZGCM菌株购自山东省宁阳县海鑫生物有限公司。1.2 仪器与设备 T20 PCR 仪,杭州朗基科学仪器有限公司;JJ1000Y 电子天平,广州绿向生物科技有限公司;ME104E/02 电子分析天平,梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;DYY-6C 电泳仪,北京六一生物科技有限公司;GelDoc XR+凝胶成像仪,美国伯乐(BIO-RAD)公司;MK-20 金属浴锅,杭州奥盛生物科技有限公司;PB-10 pH 计,德国赛多利斯;ND-1000 Nanodrop,美国 Nanodrop 公司;XW-18DL 涡旋振荡器,杭州齐威仪器有限公司;MICRO STAR 17R
17、小型冷冻离心机,美国VWR公司;Eppendorf/5804R大型台式冰冻离心,德国艾本德生物科技有限公司;LTX-320 生化培养箱,上海一恒科学仪器有限公司;SKJH-1109 超净工作台,上海苏坤实业有限公司;ULT1386-3-V6-80 冰箱,美国赛默飞世尔(ThermoFisher)公司;YX-280D 手提式压力蒸汽灭菌锅,合肥华泰医疗设备有限公司;LC-2030 高效液相色谱仪,日本岛津制作所。1.3 实验方法 1.3.1 退化梯度的建立 取 100 L 第一代的 ZGCM 菌株平板取得的孢子液涂布于 PPDA 平板,暗培养(25)23 d 后,明暗交替培养 57 d(33%光
18、照强度,单个明暗培养循环包含 12 h 的光照培养和 12 h 的暗培养),获得第二代菌株平板。取 200 L 孢子液于 PSDB 液体培养基震荡培养 45 d,待液体呈粘稠状,取 3 mL 接种至大米培养基栽培。25 暗培养23 d 后,待平板表面覆盖一层白色菌丝,转移至光照培养箱继续进行明暗交替培养(25,33%光照强度,单个明暗培养循环包含12 h的光照培养和 12 h 的暗培养)。3 周后获得第三代蛹虫草子实体。重复以上步骤,得到蛹虫草全部 17 代的菌株平板和子实体。现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2023,Vol.39,No.6
19、72 1.3.2 蛹虫草子实体 RNA 的提取 用灭菌的剪刀剪取子实体,加入液氮研磨后,尽快用药勺取半勺子实体粉末至 1.50 mL 离心管。加入300 L 抽提液(10STE Buffer,m=10%SDS,dd H2O按 2:1:7 的比例混合)和 600 L PCI,涡旋 30 s,冷冻离心处理(4,14 000 r/min,5 min)。吸取 220 L上清液至新的 1.50 mL 离心管,加入等量 PCI,涡旋20 s,冷冻离心(4,14 000 r/min,5 min)。吸取200 L 上清液至新的 1.50 mL 离心管,加入 20 L 的NaAc,轻轻混匀,再加入 440 L
20、无水乙醇,用移液枪吹打混匀,于-20 沉淀 30 min。沉淀结束后,冷冻离心(4,14 000 r/min,5 min)。去上清,加入200 L=70%乙醇进行洗涤,冷冻离心(4,14 000 r/min,5 min)。去上清,放置在空气中挥发乙醇,加入适量超纯水溶解后,通过琼脂糖凝胶电泳检测提取效果。1.3.3 残余总糖测定 依照国标方法(GB/T 15672-2009)测定残余总糖:将培养基放置在玻璃平板中,置于101105 烘箱中,加热 1 h 后,在干燥器中冷却 0.50 h。用剪刀剪成小块,在 80 干燥箱中烘至发脆,冷却后立即粉碎。称取约 0.25 g 样品,使其恒重,计算其含水
21、率。加入浓硫酸和水在 100 中水解 3 h,冷却过滤后将滤液和洗液用水定容至 250 mL 作为样品测试液。分别吸取 0、0.20、0.40、0.60、0.80、1 mL 的葡萄糖标准溶液补水至1 mL。向试管加入1 mL m=5%苯酚溶液,快速加入5 mL 浓硫酸,反应静置 10 min。涡旋混合后置于 30 中反应 20 min。取适量反应液在 490 nm 处测吸光度,以葡萄糖质量浓度为横坐标,吸光度为纵坐标,制定标准曲线。准确吸取样品测试液 0.20 mL,补水至 1 mL,按照以上步骤操作,以空白溶液调零,测得吸光度,以标准曲线计算总糖含量。样品中总糖含量以质量分数 W 计,数值以
22、百分率(%)表示,按下式计算。-6112210=100%1-mVWmV (1)式中:W总糖含量质量分数,%;V1样品定容体积,mL;V2比色测定时所移取样品测定液的体积,mL;m1从标准曲线上查得样品测定液中的含糖量,g;m2样品质量,g;样品含水量,%。1.3.4 残余总蛋白质测定 考马斯亮蓝 G250 法测定蛋白质的含量:取 6 只试管,分别加入浓度为 0、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50 mg/mL 的标准蛋白质溶液(0.50 mg/mL 牛血清白蛋白溶液)0.10 mL,然后加入 5 mL 考马斯亮试剂,振荡混匀,2 min 后于 595 nm 测定吸光值。以蛋白质浓度
23、为横坐标,光吸收值为纵坐标绘制标准曲线。再取 0.10 mL 样品溶液,加入 5 mL 考马斯亮蓝,振荡混匀,2 min 后于 595 nm 处测定吸光值。从标准曲线中查出相应的浓度。1.3.5 qRT-PCR 表 1 14 个差异表达基因及其表达产物 Table 1 14 differentially expressed genes and their expression products 基因 基因ID RNA 或蛋白质 CCM_04549(内参基因)18166572 甘油醛-3-磷酸脱氢酶 CCM_00152 18162187 链丝菌素乙酰转移酶 CCM_00249 18162284
24、DNA 切除修复蛋白 CCM_02812 18164839 丝状蛋白(Rhf1),推定 CCM_03369 18165395 假设蛋白质 CCM_03489 18165515 胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶 CCM_04090 18166113-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶,推定 CCM_04231 18166254-1,3-甘露糖基转移酶(Alg3),推定 CCM_04567 18166590 DNA 双链断裂修复蛋白 CCM_04531 18166554 性发育激活因子 VeA CCM_05237 18167256 Phosducin 家族蛋白 CCM_06821 18168832 30 kDa 热休克
25、蛋白 CCM_07990 18170000 醋酸转运蛋白,推定 CCM_08733 18170738 甘露糖苷酶 CCM_09220 18171223 假设蛋白质 现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2023,Vol.39,No.6 73 Yin 等19在用 Hiseq4000 测序系统对所种植的蛹虫草 F1至 F6代进行基因测序的实验中,使用了qRT-PCR 对部分差异表达基因(Differentially Expressed Genes,DEGs)进行了检测。参照其实验方法,本研究在蛹虫草退化过程中,以蛹虫草甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Glyce
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