小儿解表口服液体外抗流感病毒作用的研究_齐心.pdf
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1、基金项目:国家自然科学基金项目()基于“脏病及腑”理论探讨宣白承气汤对与 共感染致肺肠免疫损伤及 调控机制研究;国家中医药管理局中医药循证能力建设项目()儿童流感中医防治方案循证评价研究作者简介:齐心(.),女,硕士研究生在读,研究方向:中医药防治儿童常见病,:.通信作者:王雪峰(.),女,博士,主任医师,研究方向:中医药防治儿童常见病,:.小儿解表口服液体外抗流感病毒作用的研究齐 心 王雪峰 赫 昊(辽宁中医药大学,沈阳,;辽宁中医药大学附属医院,沈阳,)摘要 目的:研究小儿解表口服液对感染 的 细胞的疗效及可能的药效机制。方法:通过不同浓度的小儿解表口服液对 细胞的毒性实验及抗病毒实验,并
2、采用 法结合 法得出药物的半数细胞毒性浓度()、半数细胞抑制浓度()及治疗指数()。应用间接免疫荧光法检测小儿解表口服液作用于感染 的 细胞神经氨酸酶的变化。利用酶联免疫吸附试验检测小儿解表口服液对 病毒模型干扰素()、表达的影响。结果:小儿解表口服液.,.,.。与模型组比较,小儿解表口服液组在 、均减少流感病毒神经氨酸酶的表达。在、个时间点中,与模型组比较,小儿解表口服液组均减少 、的释放,差异有统计学意义(均 .)。结论:小儿解表口服液对感染 的 有疗效,并且其降低、的表达,可能是产生疗效的作用机制。关键词 小儿解表口服液;流感病毒;细胞实验;法;间接免疫荧光;抗病毒指数;神经氨酸酶;型干
3、扰素 ,(,;,):,(),(),()()():.,.,.,(.):,;中图分类号:.文献标识码:流感病毒在世界范围内传播,对人类健康、公共卫生、社会经济等方面造成了许多负面影响。流感病毒分为 种类型,分别为甲()、乙()、丙()、丁()型,其中甲型是季节性流感以及流感大流行的主要类别。最近的一次流感大流行发生在 年,造成了全球 的人死亡。据相关资料显示,该病毒株继续在人类中季节性传播。针对流感病毒的感染,常常采用奥司他韦等西药治疗,但却有报道称存在耐药性的问题。而有越来越多的研究表明中药有抗流感病毒的作用,并且还具备不良反应少等优点。有研究表明中成药中的抗病毒口服液、柴胡退热颗粒,中药提取物
4、中的栀子提取物、板蓝根多糖、细辛多糖、刺五加苷等等均有抗甲型流感病毒的作用,并且有研究对相关机制进行了探讨。小儿解表口服液是由多种中药组成的中成药,用于治疗小儿外感风热引起的感世界中医药 年 月第 卷第 期冒。风热感冒在现代医学中属于急性呼吸道感染,多为病毒性感染。由此想研究小儿解表口服液对抗流感病毒的疗效。本研究建立感染 的 细胞模型,根据相关实验说明小儿解表口服液抗流感病毒的作用。材料与方法.材料.细胞与病毒人肺癌肺泡基底上皮细胞()(广 州 赛 库 生 物 技 术 有 限 公 司,批 号:)。细胞用含 胎牛血清 于 、培养箱培养。毒株 (),由辽宁中医药大学附属医院病毒室提供。使用前接种
5、于 日龄鸡胚尿囊腔,传代培养,血凝实验滴定病毒效价,血凝效价在 以 上 者,保存。本研究经过医学伦理委员会审批(伦理审批号:)。.药物 小儿解表口服液(威海人生药业有限公司,批号:);可威(磷酸奥司他韦颗粒)(宜昌 东 阳 光 长 江 药 业 股 份 有 限 公 司,批 号:)。.试剂与仪器 培养基(大连美仑生物技术有限公司,批号:);胎牛血清(公司,美国,批号:);无菌磷酸盐缓冲液(,)(公司,美国,批号:);胰蛋白酶消化液(苏州新赛美生物科技有限公司,批号:);二甲基亚砜(北京索莱宝科技有限公司,批号:);噻唑蓝(北京索莱宝科技有限公司,批号:);羊抗兔 ()(公司,美国,批号:);(北京
6、博奥森生物技术有限公司,批号:);,二脒基苯基吲哚(,)(北京索莱宝科技有限公司,批号:);封闭山羊血清(北京索莱宝科技有限公司,批号:);多聚甲醛固定液(苏州新赛美生物科技有限公司,批号:);(北京索莱宝科技有限公司,批号:);缓冲液(北京索莱宝科技有限公司,批号:);抗荧光淬灭封片液(上海碧云天生物技术有 限 公 司,批 号:);试剂盒(公司,美国,批号:),试剂盒(公司,美国,批号:)。生物安全柜(上 海 力 申 科 学 仪 器 有 限 公 司,型 号:);二氧化碳培养箱(公司,美国,型号:);低速台式离心机(上海安亭科学仪器厂,型号:);倒置显微镜(公司,德国,型号:);荧光倒置显微镜
7、(公司,日本,型号:);酶标仪(公司,美国,型号:)。.方法.分组与模型制备设置正常组,模型组,小儿解表口服液组,磷酸奥司他韦组。细胞长满单层后,用 组织培养感染量(,)流感病毒液吸附,后吸去病毒液,换上维持液。.给药方法将小儿解表口服液用无血清培养液稀释成 ,磷酸奥司他韦颗粒配制成 。再用无血清培养液分别作 倍稀释,即 ,稀释成 个浓度,保存备用。根据实验需求,将含药维持液加入到 细胞模型中,按照相应实验时间进行不同时间吸附。.药物细胞毒性实验取对数生长期的 细胞,胰蛋白酶消化成细胞悬液,在 孔板上,每孔加入 细胞,待 长成单层后,分别加入小儿解表口服液、磷酸奥司他韦 个稀释度的含药维持液,
8、置于、培养箱培养 。每个浓度设 个复孔,并设正常细胞对照组。每日于倒置显微镜下观察致细胞病变(,)。后吸出孔中液体,用磷酸盐缓冲液(,)冲洗细胞 遍,每孔加入 的 溶液,孵育 ,弃上清液,每孔加入 二甲基亚砜溶液,振荡 ,置酶标测定仪上,测定 波长处的光密度(,)值。计算细胞存活率,细胞存活率 药物处理组 值 正常细胞对照组 值 。以统计软件 .对数据进行 回归分析,计算药物的半数细胞毒性浓度(,)。.药物抗 流感病毒治疗指数实验在长满单层 细胞的 孔板上,每孔接种 的 的流感病毒液,吸附 ,弃上清液。根据细胞毒性实验的结果,在小儿解表口服液和磷酸奥司他韦半数细胞毒性浓度范围内,分别加入不同浓
9、度含药维持液,置于、培养箱 ,培养 。每个浓度设 个复孔,同时设正常细胞对照组和病毒对照组。每日于倒置显微镜下观察。后吸出孔中液体,用 冲洗细胞 遍,每孔加入 的 溶液,孵育,弃上清液,每孔加入 二甲基亚砜溶液,振荡 ,置酶标测定仪上,测定 波长处的光密度 值。计算病毒抑制率,病毒抑制率(药物处理组 值 病毒对照组 值)(细胞对照组 值 病毒对照组 值)。对各浓度组所得病毒抑制率进行 回归分析,并计算半数细胞抑制浓度()。采用治疗指数(,)作为评价指标,用以评价药物对流感病毒的抑制效力,。.间接免疫荧光实验在细胞培养小室中分别加入 的 细胞悬液,待长成单层后,吸弃废液,每格接种 的病毒液,吸附
10、 ,弃上清液。分别加入 的小儿解表口服液和磷酸奥司他韦含药维持液,置于、培养箱培养、。同时设置正常组和模型组。在 、个时间点分别取出小室。用的多聚甲醛室温固定,.透化,封闭山羊血清室温封闭,加神经氨酸酶一抗()放在湿盒里 过夜,加 羊抗兔 二抗()室温反应 ,核染,冲洗 次,蒸馏水冲洗,抗荧光淬灭封片剂封片,于倒置荧光显微镜观察。.酶联免疫吸附试验检测干扰素(,)拆除培养小室时分别收取不同组别细胞上清液于 离心管中,离心(离心半径.、转速 、时间)取上清液,使用相应的酶联免疫吸附试验试剂盒检测细胞上清液中的、,利 用 酶 标 仪 在 下 读 取 值。.统计学方法采用 .统计软件进行数据分析,软
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