外周血细胞外囊泡中lncRNAH19对原发性胆汁性胆管炎患者肝纤维化的预测价值分析.pdf
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1、165国际消化病杂志 2023 年 6 月 25 日第 43 卷第 3 期 Int J Dig Dis,June 25,2023,Vol.43,No.3 论著 作者单位:054099 邢台市第三医院内科(李华),康复科(刘俊英),病理科(张建刚),消化内科(王占魁),超声科(李俊青)通信作者:李俊青,Email:外周血细胞外囊泡中 lncRNA H19 对原发性胆 汁性胆管炎患者肝纤维化的预测价值分析李 华 刘俊英 张建刚 王占魁 李俊青【摘要】目的 探讨原发性胆汁性胆管炎(PBC)患者外周血细胞外囊泡中长链非编码 RNA(lncRNA)H19 表达水平对肝纤维化的预测价值。方法 选择 202
2、1年 8 月至 2022 年 8 月在邢台市第三医院经肝穿刺活体组织病理检查确诊为 PBC 的84 例患者设为 PBC 组,另选择同期来院的 46 名健康体检者设为对照组。在超声引导下行经皮肝穿刺获取 PBC 患者的肝脏病变组织,采用 Scheuer 评分系统进行肝纤维化分期及肝脏炎症反应分级。提取外周血细胞外囊泡,在透射电镜下观察其形态结构。采用纳米颗粒示踪分析法对外周血细胞外囊泡中颗粒数进行定量分析,蛋白质印迹法测定外周血细胞外囊泡的特异性标志物表达水平,实时荧光定量 PCR 法测定外周血细胞外囊泡中 H19 的表达水平。采用 ROC 曲线下面积(AUC)评估外周血细胞外囊泡中 H19 表
3、达水平对 PBC 患者肝纤维化程度的预测价值。结果 PBC 组和对照组的外周血细胞外囊泡直径约为 100 nm,均有完整膜结构,囊泡表面均可检测出 CD63、肿瘤易感基因 101 蛋白(TSG101)、ALG-2 相互作用蛋白X(Alix)的表达,且PBC组的上述蛋白表达水平均显著高于对照组(P均0.05)。PBC 组的外周血细胞外囊泡中 H19 表达水平显著高于对照组(P0.05)。抗线粒体抗体 M2 型(AMA-M2)阳性、抗核膜糖蛋白 210(GP210)抗体阳性、肝脏炎症反应 G2G3 级的 PBC 患者外周血细胞外囊泡中 H19 表达水平分别较 AMA-M2阴性、抗 GP210 抗体
4、阴性、肝脏炎症反应 G0G1 级的 PBC 患者均显著升高(P 均0.05)。随着肝纤维化的进展,PBC 患者外周血细胞外囊泡中 H19 的表达水平逐渐升高,各期肝纤维化患者两两比较,差异均有统计学意义(P 均0.05)。Pearson 相关性分析结果显示,外周血细胞外囊泡中 H19 的表达水平与肝纤维化分期呈显著正相关(r0.658,P0.05)。外周血细胞外囊泡中 H19 预测肝纤维化、进展期肝纤维化及肝硬化的 AUC 分别为 0.721、0.745 和 0.784。结论 PBC 患者外周血细胞外囊泡中 lncRNA H19 的表达水平显著升高,并且其与肝纤维化及肝脏炎症反应严重程度均有相
5、关性,有潜力成为预测肝纤维化的生物标志物。【关键词】原发性胆汁性胆管炎;肝纤维化;肝脏炎症反应;细胞外囊泡;长链非编码 RNA H19DOI:10.3969/j.issn.1673-534X.2023.03.007Analysis of predictive value of lncRNA H19 in extracellular vesicles of peripheral blood cells for liver fibrosis in patients with primary biliary cholangitis LI Hua.Department of Internal Medi
6、cine,Xingtai Third Hospital,Xingtai 054099,China;LIU Junying.Department of Rehabilitation,Xingtai Third Hospital,Xingtai 054099,China;ZHANG Jiangang.Department of Pathology,Xingtai Third Hospital,Xingtai 054099,China;WANG Zhankui.Department of Gastroenterology,Xingtai Third Hospital,Xingtai 166国际消化病
7、杂志 2023 年 6 月 25 日第 43 卷第 3 期 Int J Dig Dis,June 25,2023,Vol.43,No.3054099,China;LI Junqing.Department of Ultrasound,Xingtai Third Hospital,Xingtai 054099,China【Abstract】Objective This paper aims to investigate the predictive value of long chain non-coding RNA(lncRNA)H19 expression in the extracellu
8、lar vesicles of peripheral blood cells in patients with primary biliary cholangitis(PBC)for liver fibrosis.Methods From August 2021 to August 2022,eighty-four patients diagnosed as PBC by liver biopsy in Xingtai Third Hospital were assigned to the PBC group,and forty-six healthy examinees who came t
9、o the hospital during the same period were assigned to the control group.Under ultrasound guidance,percutaneous liver puncture was performed to obtain liver lesion tissue from PBC patients,and the Scheuer scoring system was used to stage liver fibrosis and grade liver inflammation.Extracellular vesi
10、cles were extracted from peripheral blood cells and their morphological structure was observed under transmission electron microscopy.The number of particles was quantitatively analyzed by nanoparticle tracing analysis.Protein blotting was used to determine the expression level of specific biomarker
11、s in extracellular vesicles of peripheral blood cells,and real-time fluorescence quantitative PCR was used to determine the expression level of H19 in extracellular vesicles.The area under the ROC curve(AUC)was used to analyze the predictive value of H19 expression levels in extracellular vesicles o
12、f peripheral blood cells for the degree of liver fibrosis in PBC patients.Results The extracellular vesicles of peripheral blood cells in the PBC group and the control group have a diameter of about 100 nm and a complete membrane structure.The expression of CD63,tumor susceptibility gene 101 protein
13、(TSG101),and ALG-2 interaction protein X(Alix)can be detected on the vesicle surfaces,and the expression levels of the above proteins in the PBC group are significantly higher than those in the control group (P0.05).The H19 expression level in extracellular vesicles of peripheral blood cells of the
14、PBC group is significantly higher than that of the control group(P0.05).The H19 expression levels in extracellular vesicles of peripheral blood cells of PBC patients with positive anti mitochondrial antibody M2(AMA-M2),anti nuclear membrane glycoprotein 210(GP210)antibody,and liver inflammation G2G3
15、 grades are significantly higher than those of PBC patients with AMA-M2 negative,anti GP210 antibody negative,and liver inflammation G0G1 grades,respectively(P0.05).With the progression of liver fibrosis staging,the H19 expression level in extracellular vesicles of peripheral blood cells of PBC pati
16、ents gradually increases.The differences between patients in each liver fibrosis stage are statistically significant(P0.05).Pearson correlation analysis shows that the H19 expression level in extracellular vesicles of peripheral blood cells is significantly positively correlated with the stage of li
17、ver fibrosis(r0.658,P0.05).The AUC of H19 in extracellular vesicles of peripheral blood cells predicting liver fibrosis,advanced liver fibrosis,and cirrhosis are 0.721,0.745,and 0.784,respectively.Conclusion The lncRNA H19 expression level in extracellular vesicles of peripheral blood cells of PBC p
18、atients is significantly increased,and is correlated with the severity of liver fibrosis and liver inflammation,which has the potential to become a biological indicator for predicting liver fibrosis.【Key words】Primary biliary cholangitis;Liver fibrosis;Liver inflammation;Extracellular vesicles;lncRN
19、A H19原发性胆汁性胆管炎(PBC)是由肝内胆汁淤积引起的自身免疫性肝病,可导致胆管广泛破坏,形成胆汁性肝硬化,最终进展为肝衰竭1。肝脏活体组织病理检查是目前诊断和评估肝纤维化的金标准,但费用较高且为有创性检查,患者接受度不高2-3。因此,亟需探寻有效、简便、费用较低的无创性检查方法。细胞外囊泡是近年来研究热点,目前多数学者认为肝脏是细胞外囊泡主要分布脏器和作用靶点,在肝脏炎症反应及肝纤维化的诊断和治疗中可能具有重要价值4-5。细胞外囊泡中富含大量蛋白质、RNA、DNA 等,但目前国内外对细胞外囊泡的研究多数聚焦于 miRNA 和信使 RNA(mRNA),对长链非编码 RNA(lncRNA)
20、的研究较少6。lncRNA H19 与免疫、炎症反应及细胞凋亡等密切相关,有研究表明其可能参与了胆汁淤积性肝纤维化的进展7。本研究探讨了外周血细胞外囊泡中 H19 对初诊、初治的 PBC 患者肝纤维化的预测价值,以期为 PBC 患者的临床诊断和预后评估提供可靠依据。167国际消化病杂志 2023 年 6 月 25 日第 43 卷第 3 期 Int J Dig Dis,June 25,2023,Vol.43,No.31 临床资料与方法1.1 临床资料选择 2021 年 8 月至 2022 年 8 月在邢台市第三医院在超声引导下经肝穿刺活体组织病理检查确诊为 PBC 的 84 例患者设为 PBC
21、组。纳入标准:(1)1880 岁;(2)经临床症状、生物化学检查、影像学检查等综合评估确诊为 PBC8;(3)为初次诊断为 PBC,未经相关治疗;(4)肝穿刺活体组织病理检查前 1 周内行血清学检查。排除标准:(1)合并其他类型肝病;(2)合并恶性肿瘤、其他自身免疫病;(3)孕妇或哺乳期妇女。另选择同期来院的 46 名健康体检者设为对照组。纳入标准:(1)无免疫系统及消化系统疾病史;(2)近 1 个月内无药物服 用史。84 例 PBC 患者中,男性 31 例,女性 53 例,年龄 3678 岁,平均年龄为(59.7812.49)岁;抗线粒体抗体 M2 型(AMA-M2)阳性 72 例,抗核膜糖
22、蛋白 210(GP210)抗体阳性 31 例,抗可溶性酸性核蛋白 100(SP100)抗体阳性 9 例;肝纤维化分期:S0 期 5 例,S1 期 24 例,S2 期 27 例,S3 期 16 例,S4 期 12 例;肝脏炎症反应分级:G0 级 3 例,G1级 29 例,G2 级 34 例,G3 级 18 例。46 名健康体检者中,男性 14 名,女性 32 名,年龄 3880 岁,平均年龄为(56.1511.23)岁。2 组的年龄和性别差异均无统计学意义(P 均0.05),具有可比性。所有受试者均签署知情同意书,本研究获得医院医学伦理委员会批准。1.2 方法1.2.1 肝脏活体组织病理检查 在
23、超声引导下行经皮肝穿刺获取 PBC 患者的肝脏病变组织,裁剪为 1.52.5 cm 长度,用 4%多聚甲醛固定 24 h,石蜡包埋,连续切片;经 Masson 三色、H-E、网状纤维等染色后,由 2 位经验丰富的病理科医生共同阅片,观察肝组织及细胞病理形态学变化。采用Scheuer 评分系统9进行肝纤维化分期及肝脏炎症反应分级。肝纤维化分期:S0 期为无胶原纤维沉积;S1 期为轻度纤维瘢痕形成,汇管区扩大;S2期为汇管区纤维化,有纤维间隔形成;S3 期为纤维间隔形成,伴有小叶结构紊乱;S4 期为肝硬化。将S1 期定义为肝纤维化,S3 期定义为进展期肝纤维化,S4 期定义为肝硬化。肝脏炎症反应分
24、级:G0 级为无炎症反应,G1 级为轻度炎症反应,G2级为中度炎症反应,G3 级为重度炎症反应。1.2.2 提取外周血细胞外囊泡 抽取受试者空腹静脉血 10 mL,3 000 r/min 离心 10 min,取血浆,每管 2 mL 分装后保存于-80 冰箱。在 4 下融化冻存的血浆标本,用无菌 PBS 以 1 10 比例稀释,12 000 r/min 离 心 30 min,然 后 110 000 r/min 离 心120 min 和 70 min(2 次离心间隔 25 min),置于-80 冰箱保存。1.2.3 透射电镜观察 取稀释后的细胞外囊泡样本,用 2%戊二醛固定,取 10 L 滴至铜网
25、,随后依次滴加 3%磷钨酸和纯水,两者间隔 2 min;吸取多余液体,待干,使用 HITACHI H-9500 透射电镜(购自日本 HITACHI 公司)观察细胞外囊泡形态结构并拍照。1.2.4 纳 米 粒 子 示 踪 分 析 以 1 50 比 例 用 无菌 PBS 溶 液 重 悬,取 1 mL 稀 释 后 样 本,使 用NanoSight NS300 纳米颗粒示踪分析仪(购自英国Malvern Panalytical 公司)对细胞外囊泡中颗粒数进行定量分析,每个样本重复 3 次,取平均值。1.2.5 蛋白质印迹法测定细胞外囊泡特异性标志物的表达水平 细胞外囊泡样本加至 10DNA 凝胶加样缓
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