稳定表达CD19的非小细胞肺癌细胞系的构建_朱帅旗.pdf
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1、第 卷第期湖北工业大学学报 年 月 收稿日期 第一作者朱帅旗(),男,河南商丘人,湖北工业大学硕士研究生,研究方向为生物工程 通信作者刘滨磊(),男,湖北武汉人,湖北工业大学教授,研究方向为生物制药 文章编号 ()稳定表达 的非小细胞肺癌细胞系的构建朱帅旗,张帆,詹思建,段海潇,王迪,胡翰,汪洋,刘滨磊(湖北工业大学生物工程与食品学院,湖北 武汉 )摘要细胞系表达的 可被靶向 的嵌合抗原受体()特异性识别。为探究靶向 抗肿瘤疗效及机制提供可靠稳定的靶细胞系,运用 脂质体转染法将 和 质粒转入 细胞。嘌呤霉素()筛选,稳定细胞株 单克隆细胞由有限稀释法得到;鉴定 细胞系中 的表达;流式细胞术检测
2、 中 的表达;法比较改造前后细胞系的生长活性变化。经 抗性筛选和挑取单克隆,得到个 单克隆细胞;鉴定 细胞系均有 高表达;流式检测单克隆细胞系阳性率均达到;法检测发现 细胞系与亲本细胞 细胞具有一致的生长活性。运用 转座系统构建稳定表达 的 细胞系成功,为评估靶向 实体瘤 疗效提供靶细胞,奠定 细胞抗实体瘤疗效机制研究基础。关键词 细胞;绿色荧光蛋白 中图分类号 文献标识码人 是由胞外末端、跨膜结构域与胞内末端组成的跨膜糖蛋白,其大小为 ,在多数细胞中极其保守,但在多数慢性和急性淋巴细胞白血病及细胞淋巴瘤中过表达。作为关键标记物已被用于白血病、淋巴瘤及免疫疾病的诊断预后评判指标,也为治疗这些疾
3、病提供了靶点。多个靶向 的双特异性抗体与 细胞免疫疗法已在临床试验中取得进展,临床实验也证实其良好的疗效,但其在实体瘤组织中的疗效研究较少。据 等报道,抗实体瘤具有可 行 性。此 外,等 人 发 现 在肺癌模型中具有优异的抗肿瘤活性。新英格兰杂志报道了 细胞疗法治疗恶性胶质瘤晚期患者案例,经多次输注 细胞后,患者病症得到完全缓解,这启示了 疗法在实体瘤具有可行性。限于 大多表达在血液淋巴瘤,而淋巴瘤细胞多存在于病人血液内,为研究 的抗肿瘤机制带来了不便。而实体瘤细胞具有体外易培养与体内易成瘤的特点,便于评估 抗实体瘤疗效机制。人非小细胞肺癌 细胞系作为常用肿瘤研究细胞模型,在肺癌研究中最具代表
4、性,因此本研究拟构建稳定表达 的 细胞系以便于后续 抗实体瘤疗效机制研究。此外,用于构建稳转细胞系的常见载体有慢病毒载体和转座子载体,本研究采用的是实验室前期开发的 转座质粒系统。本研究使用带有 基因的转座质粒和表达转座酶的质粒,将带有 基因的转座序列转座至 细胞染色体 上,实 现 细 胞 稳 转。此 外,绿 色 荧 光 蛋 白(,)具有探针的特性,作为报告基因标记特定分子或细胞为科学研究提供极大便利。在本研究中,作为荧光标记,在细胞系筛选、单克隆挑选等步骤起重要作用。本研究构建稳定表达 的 细胞系,旨在为评估靶向 实体瘤 疗效机制提供理想靶细胞模型。实验材料从北京协和医院细胞中心获得 细胞;
5、用(,)培养 细胞;于浙江天杭生物购买 。从 购买 转染试剂盒;重组质粒和 ()转座酶质粒由本实验室改造并保 存。无 内 毒 素 质 粒 小 提 中 量 试 剂 盒 购 于 公司。嘌呤霉素()与 分别购于碧云天生物和 公司;大肠杆菌 感受态由本团队自主制备。抽提和 逆转录试 剂 盒 于 和 购 买,荧光染料于 公司购买。抗体于 公司购买。流式细胞检测仪();体 视 荧 光 显 微 镜(公 司);荧 光 定 量 仪(),多功能酶标仪();北京东联哈尔二级生物安全柜。实验方法质粒提取于 超低温冰箱中取出甘油保存的 (即 质 粒菌,由实验室成功构建),将解冻菌液以 的比例接种至 液体培养基中,加入
6、使其终浓度为 ,摇菌。使用质粒试剂盒提取质粒并测浓度和纯度。细胞对嘌呤霉素的敏感性实验收集 细胞并离心(,),离心后重悬细胞并计数。细胞铺 孔板(个孔),于,湿润的培养箱培养。次日于细胞孔中加入梯度浓度的 ,之后每天观察细胞贴壁百分比并做记录,共计。期间每 换含 的新鲜培养基,在第天确定 细胞的最低致死浓度。细胞转染转染前天,用 胰酶消化 细胞,终止消化后收集细胞悬液至离心管,于 下离心 后弃上清重悬计数。之后调整细胞密度,接种至 孔板,个孔,将细胞放入细胞培养箱过夜培养。第天当细胞汇合度达到 时进行质粒转染:按 转染 试 剂 说 明 书 以()()的质粒质量比转染 细胞。用体视荧光显微镜下观
7、察转染 后细胞的 表达率。抗性筛选与 单克隆细胞系挑选 细胞转染 后,按确定的最低致死浓度筛选转染细胞。其间,每天换一次含 的新鲜培养基,待所剩细胞均表达 时进行单克隆挑选。将孔板内细胞消化后计数,根据计数的细胞密度进行梯度稀释,稀释密度为 个。孔板预加 培养基,接种细胞,每孔 细胞悬液。孔板放入细胞培养箱,后记录单个细胞孔。待细胞克隆形成后于体视荧光显微镜下判断表达 情况,筛选出表达 细胞克隆并将其扩大培养,依次扩培到 孔板、孔板、孔板、培养瓶中。检 测 单 克 隆 细 胞 系 的表达从 数据库获取 和 基因转录 序列并设计 荧光染料定量 引物,送 基 因 公 司 合 成 备 用。分 别 取
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