新疆葡萄酒对大鼠肝脏功能及肝细胞自噬的影响_王妍凌.pdf
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1、研究报告 年第 卷第 期(总第 期):引用格式:王妍凌,赵昊,郝飞克,等 新疆葡萄酒对大鼠肝脏功能及肝细胞自噬的影响 食品与发酵工业,():,():新疆葡萄酒对大鼠肝脏功能及肝细胞自噬的影响王妍凌,赵昊,郝飞克,陈杉彬,于佳俊,张晓蒙,朱嘉伟,吕嘉伟,武运,薛洁,(新疆农业大学 食品科学与药学学院,新疆 乌鲁木齐,)(中国食品发酵工业研究院有限公司,北京,)(国家酒类品质与安全国际联合研究中心,北京,)摘 要 该实验为了探讨新疆葡萄酒对肝脏及肝细胞自噬的影响,将雄性 大鼠随机分为 组:空白组()、酒精组()、吐哈盆地干白葡萄酒组()、天山北麓干红葡萄酒组()、伊犁河谷干红葡萄酒组()、焉耆盆地
2、干红葡萄酒组(),用新疆不同产区葡萄酒灌胃雄性 大鼠 周后,检测 组大鼠体重变化和肝脏系数、肝脏组织病理形态学变化、血清中谷丙转氨酶(,)、谷草转氨酶(,)含量,并通过 检测肝脏组织中自噬相关蛋白、表达水平。结果表明,与空白组相比,、葡萄酒组大鼠体重增长趋势较缓,酒精组大鼠体重增长趋势最缓,与酒精组相比,、葡萄酒组肝脏系数显著降低(),肝脏未见明显病变,大鼠血清中总胆固醇(,)、甘油三酯(,)、低密度脂蛋白胆固醇(,)、血尿素氮(,)、血肌酐(,)、总蛋白(,)、白蛋白(,)、血糖(,)呈降低趋势,高密度脂蛋白胆固醇(,)有上升趋势(),球蛋白(,)含量无显著差异,蛋白含量升高,蛋白含量降低,
3、且都达到了显著水平()。机体适量摄入葡萄酒一定程度上能降低肝脏系数、调节大鼠体内血清理化指标及肝脏功能、促进肝细胞自噬水平,从而减少酒精对肝脏的损伤,这可能与葡萄酒中含有的酚类物质有关。关键词 新疆葡萄酒;大鼠;肝脏损伤;细胞自噬第一作者:硕士研究生(武运教授和薛洁教授级高级工程师为共同通信作者,:;)基金项目:新疆维吾尔自治区重大科技专项()收稿日期:,改回日期:肝脏是一个重要的代谢和解毒器官,可以在受损的情况下快速激活未受损伤的肝细胞,进而恢复肝脏的生物学功能。酒精是肝脏损伤的主要原因之一,酒精性肝病(,)通常包括酒精性脂肪肝或单纯性脂肪变性、酒精性肝炎、酒精性肝纤维化或肝硬化。临床上可通
4、过皮质类固醇、己酮可可碱等进行治疗,但这些药物副作用明显。细胞自噬是指由自噬相关基因介导,待降解物被一种双层膜结构包裹形成自噬体,再运输到溶酶体通过膜融合形成自噬溶酶体,由自噬溶酶体中的一系列水解酶消化包裹的待降解底物,以此来支持细胞自身代谢和某些细胞器更新的过程,在调节细胞生命活动中具有重要生理意义。研究表明,细胞自噬能影响许多肝脏功能,在肝脏生理和病理过程中发挥着重要作用。机体长期摄入过量酒精会产生大量活性氧(,),会氧化和破坏线粒体产生的脂质、核酸和氨基酸前体等,导致线粒体功能障碍,从而诱导细胞自噬,清除受损蛋白质及细胞器,缓解氧化压力。葡萄酒是以葡萄为原料,进行发酵的一种天然酒精类饮品
5、,含有人体所需的部分营养成分及生理活性物质,如锌、有机酸、肌醇、益生菌、多酚类化合物和植物雌激素等。葡萄酒中酚类化合物含量和种类较多,并且具有调节肠道菌群、降血脂,抗动 脉 粥 样 硬 化(,)等 功效。杨志伟等运用 测定了葡萄酒中白藜芦醇、根皮苷、橙皮苷等 种单体酚。其中芥子酸、水杨酸、杨梅素等具有明显的抗氧化能力,同时酚类物质具有一定的护肝作用。一定剂量的根皮苷和根皮素主要通过激活 氧化通路,上调、的 表达水平,进而保护肝细胞氧化损伤。白藜芦醇能通过调控 相关信号通路而上调自噬活性进而抑制肝细胞脂肪变食品与发酵工业 ()性,从而使其达到改善非酒精性脂肪性肝病(,)的生理作用。但目前从新疆不
6、同产区葡萄酒整体对细胞自噬的作用来探讨葡萄酒对健康影响的研究还较少。因此,本实验以新疆不同产区葡萄酒为研究对象,在分析葡萄酒对健康大鼠生理功能影响的基础上,从细胞自噬的层面对健康大鼠肝脏损伤影响进行分析,进而为健康饮酒评价体系以及对缓解肝脏损伤的功能物质筛选提供新思路。材料与方法 材料与试剂葡萄酒样品:采于新疆吐哈盆地、天山北麓、伊犁河谷、焉耆盆地四大产区。实验动物:健康雄性 级 大鼠 只,周龄,平均体重(),购于斯贝福(北京)生物技术有限公司,动物许可证号为(京),所有动物都被喂养在无病原体的环境中,动物的护理和使用程序得到了北京医学伦理委员会的批准,并遵守所有适用的有关动物伦理使用的机构和
7、政府法规。蛋白浓度测定试剂盒,北京索莱宝科技有限公司;兔抗微管相关蛋白轻链 (,)、,日本 公司;、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔 二抗,美国 公 司;谷 丙 转 氨 酶(,)、谷草转氨酶(,)、总胆固醇(,)、血清中甘油三酯(,)、高密度脂蛋白胆固醇(,)、低密度脂蛋 白 胆 固 醇(,)、血尿素氮(,)、血肌酐(,)、白蛋白(,)、总蛋白(,)、球蛋白(,)、血糖(,)试剂盒,南京建成生物公司。仪器与设备 多功能酶标仪,美国 公司;转移脱色摇床,泰州诺米医疗有限公司;病理切片机,阔海医疗有限公司;小型台式离心机,美国 公司;化学发光成像系统,上海勤翔科学仪器有限公司。实验方法 大鼠分组及灌胃
8、将大鼠适应性喂养 ,随机分为空白组()、酒精组()、吐哈盆地干白葡萄酒组()、天山北麓干红葡萄酒组()、伊犁河谷干红葡萄酒组()、焉耆盆地干红葡萄酒组(),详情见表。空白组灌胃蒸馏水,其他各组灌胃相应葡萄酒,葡萄酒样品的灌胃剂量参照文献,干红葡萄酒组灌胃标准为 ,干白葡萄酒组灌胃标准为 ,灌胃剂量随大鼠状态及体重变化而调整,共持续。表 灌胃样品及分组信息 灌胃编号样品名称酿造原料产区年份酒精度蒸馏水酒精干白葡萄酒霞多丽吐哈盆地干红葡萄酒赤霞珠天山北麓干红葡萄酒赤霞珠伊犁河谷干红葡萄酒赤霞珠焉耆盆地 体重和肝脏系数测定实验期间每周定时记录大鼠体重。解剖前,称重并记录各大鼠体重,计算大鼠体重:体重
9、 终体重()初始体重()()大鼠处死后,立即取肝脏,进行称重,并计算肝脏系数:肝脏系数 肝脏质量()动物体重()()血清生化指标测定大鼠眼眶取血后,自然沉降 ,、离心,取上清液保存;、测定按照试剂盒操作。肝脏苏木精伊红(,)染色大鼠眼眶取血后,颈椎脱臼处死,取肝脏同一部位组织块固定,其余组织放入液氮速冻,保存备用。将固定后的肝组织进行包埋、染色,具体方法参照文献。检测、蛋白表达将 冰箱中的肝脏组织室温解冻后,取样品组织进行匀浆、裂解、蛋白提取等操作,并用 试剂盒测定并调整其浓度,制备上样样品。上样样品制备完成后,进行电泳、转膜、封闭、一抗孵育、清洗、二抗孵育、清洗、显影、拍照,具体方法参照文献
10、。研究报告 年第 卷第 期(总第 期)数据处理实验数据均为 个平行试验的平均值,用平均值 标准误表示,软件 进行统计分析,不同实验组组间比较采用 检验,检验水准 ,并采用 软件作图。结果与分析 不同处理对大鼠体重及肝脏系数的影响体重的变化趋势是实验动物整体情况最直观的反馈,可以为灌胃剂量调整及喂养条件等的改变提供依据。如图 所示,大鼠的平均体重总体呈增长趋势;但 酒精组大鼠在灌胃 周后,体重较其他组增长缓慢,可能是由于酒精麻痹大脑神经,进而影响动物食量所致,提示长期酗酒会对机体神经造成损伤;、葡萄酒组较空白组体重增长少,较酒精组增长多,并且、干红葡萄酒组较 干白葡萄酒组体重增长多,推测这可能是
11、由于干红葡萄酒中多酚类物质含量高,多酚类物质一定程度上具有帮助恢复机体消化功能的作用。肝脏系数广泛用于毒理学评价,其数值超过正常范围时,提示肝脏可能出现肥胖、充水、充血等病症;其数值低于正常范围时,提示肝脏可能出现肝脏机能衰亡类病症。由图 可知,对比空白组,酒精组大鼠肝脏指数显著增加(),说明长期灌胃酒精导致肝脏一定程度上病变肿大。与酒精组相比,、葡萄酒组大鼠肝脏系数显著降低(),且、干红葡萄酒组较 干白葡萄酒组降低的趋势更显著,降低率达到了 和 。说明与酒精相比,葡萄酒能一定程度的减缓酒精造成的肝组织肿大,并且干红葡萄酒的作用更显著,因此推测干红、干白葡萄酒中的酚类物质在一定程度上能减少酒精
12、对肝脏的损伤作用。大鼠肝脏组织病理变化图 是各组大鼠肝脏组织的病理学切片光镜观察结果,由图 可知,空白组大鼠肝脏组织结构及着色状况良好,肝细胞呈放射状排列且细胞器边缘清晰;酒精组大鼠肝细胞排列较为松散,细胞间隙可见大小不等的空泡,并且肝细胞有肿大现象;、葡萄酒组的大鼠肝脏组织部分出现轻度水肿和部分空泡(图 中红色圆圈部分),但均未见明显病变。不同处理对大鼠血脂功能的影响血清中、超过正常水平会引起血脂异常。资料报道,机体摄入葡萄酒能一定程度升高 水平。通过将胆固醇转化为胆汁酸或直接从肠道排出体外,达到对心血管的保护作用。本研究比较了大鼠摄入不同葡萄酒后血脂功能指标的变化,结果如图 所示。图 各组
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