银腺杨不同部位叶片形态、生理及转录差异分析_毕楷杰.pdf
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1、植物遗传资源学报 2023,24(3):829-842DOI:10.13430/ki.jpgr.20220924002Journal of Plant Genetic Resources银腺杨不同部位叶片形态、生理及转录差异分析毕楷杰,孙耀国,杨敏生,张军(河北农业大学林学院/河北省林木种质资源与森林保护重点实验室,保定 071000)摘要:本研究以银腺杨成年树木为对象,测定了不同类型叶片形态、生理和基因表达差异,为揭示银腺杨的成熟效应提供参考。主要研究结果如下:(1)长枝叶和短枝叶的叶片形态差异显著,不同部位的叶片有很大程度的重叠。(2)不同部位叶片所含化合物差异显著,即:下部叶片的叶绿素a
2、和叶绿素总含量显著大于上部和中部;下部叶片的SOD酶活性显著高于上部和中部,MDA含量表现为中部上部下部;下部叶片的淀粉含量显著低于上部和中部;不同部位叶片的IAA含量随着高度的降低而上升,ABA含量表现为中部上部下部;长枝叶的IAA和IAA/ABA显著大于短枝叶,ZR含量呈现相反的变化趋势。(3)基于转录组数据对差异显著基因进行筛选,不同部位叶片之间的差异显著基因数量少于不同类型叶片之间差异显著基因数量。(4)对各比较组的差异显著基因进行GO和KEGG富集分析,结果显示上部长枝叶相对于下部长枝叶(SC-vs-XC)、上部短枝叶相对于下部短枝叶(SD-vs-XD)差异显著基因显著富集到光合作用
3、通路上,对其中的2个基因进行基因注释,发现这2个基因均编码PsbR蛋白,且下部叶片中基因表达量上调;对生长素转导过程进行分析,发现短枝叶中相关基因表达量均上调。关键词:银腺杨(Populus alba P.glandulosa);叶片形态;生理特性;转录差异Leaf Morphology and Physiological Analysis of Different Parts of Silver Glandular PoplarBI Kai-jie,SUN Yao-guo,YANG Min-sheng,ZHANG Jun(College of Forestry Science,Agricul
4、tural University of Hebei/Hebei Key Laboratory for Tree Genetic Resources and Forest Protection,Baoding 071000)Abstract:In this study,the morphology,physiology and transcriptome of different types of leaves were measured in adult trees of Silver Poplar,which provided a reference for revealing the ma
5、turation effect.The main results are listed:(1)The leaf morphology at long branches and short branches was significantly different,and the leaves in different parts overlap to a large extent.(2)The in different parts of leaves was significantly different,and the content of chlorophyll a and total ch
6、lorophyll in the lower leaves were significantly higher than those of the upper and middle parts.The SOD enzyme activity in the lower leaves was significantly higher than that in the upper and middle parts.The MDA content was manifested as the middle upper lower par;.The starch content in lower leav
7、es was significantly lower than that in upper and middle leaves;The IAA content of the leaves in different parts increased with the decrease of height,and the ABA content was the middle the upper part the lower part;The IAA and IAA/ABA of leaves at the long branches were significantly larger than th
8、ose of the short branches,and the ZR content showed an opposite trend.(3)The number of differentially significant genes between different parts of leaves was less than the number of differentially significant genes between different types of leaves based on transcriptome data screening.(4)GO and KEG
9、G enrichment analysis of different genes in each comparison group showed that the genes significantly enriched in the photosynthetic pathway in the upper long branching leaves relative to the lower long branching leaves(SC-vs-XC)and in the 收稿日期:2022-09-24 修回日期:2022-12-07 网络出版日期:2022-12-27URL:https:/
10、doi.org/10.13430/ki.jpgr.20220924002第一作者研究方向为林业生物技术,E-mail:通信作者:张军,研究方向为林木遗传育种,E-mail:基金项目:河北省重点研发计划项目(21326301D)Foundation project:Hebei Province Key R&D Project(21326301D)植物遗传资源学报24 卷upper short branching leaves relative to the lower short branching leaves(SD-vs-XD),and gene annotation of two of t
11、hese genes showed that both genes encoded PsbR proteins,and the gene expression was up-regulated in the lower leaves.The expression of these two genes was found to be up-regulated in the lower leaves,and the analysis of the growth hormone transduction process showed that the expression of the genes
12、was up-regulated in the shorter leaves.Key words:Populus albaP.glandulosa;leaf shape;physiological characteristics;transcriptome difference林木无性繁殖过程中,常伴随着成熟效应和位置效应。当无性繁殖材料因年龄的逐渐变大,随之产生生理衰老的现象,即成熟效应。因无性繁殖材料在原株上生长位置不同而造成影响的现象,称为位置效应。在杨树无性繁殖过程中成熟效应和位置效应常会对无性系造林造成严重影响。有研究表明成熟效应会严重影响扦插繁育和嫁接繁殖的过程1,进而对杨树的无性
13、系造林造成严重影响。成熟效应与繁殖材料的母树年龄有关,繁殖材料衰老程度越深,成熟效应越明显。不仅如此,在同一棵树上,当同种繁殖材料不在同一位置,其组织和成熟度也大不相同。为解析杨树成熟效应和和位置效应形成机制,本研究以银腺杨成年树木为对象,测定了不同部位及同一部位长枝叶和短枝叶形态及生理差异,并基于转录组测序技术探究不同部位和不同类型叶片的基因表达差异,解析不同部位及类型叶片差异的生理及分子机制。1材料与方法1.1试验材料试验材料取自河北省保定市易县洪崖山国有林场七里亭分场,为场区内一株30多年生的银腺杨,于2020年8月初从树体的同一方向分别采集树冠上部(S)、中部(Z)和树干基部(X)(以
14、下简称为:上部、中部和下部)萌生出来的枝条上的功能叶,再分别从这3个部位上采集相对位置一致的长枝叶(C)和短枝叶(D),分别用上部长枝叶(SC)、上部短枝叶(SD)、中部长枝叶(ZC)、中部短枝叶(ZD)、下部长枝叶(XC)、下部短枝叶(XD)表示6种不同处理的叶片。每一项指标的测定均采集相对位置一致的长枝叶和短枝叶(56叶位)。1.2试验方法1.2.1不同部位叶片形态变异分析对同一类型不同部位的叶片(SC/ZC/XC和SD/ZD/XD)分别进行叶片形状差异分析。(1)根据长枝叶和短枝叶的形态特征,在叶片上选取12个标志点,叶片标志点的位置及其描述详见表1和图1。利用Image J2软件对每个
15、叶片上的12个标志点进行标记,用于后续分析。(2)数据的处理把上一步的数据信息导入到Morpho J3中进行分析,分析的第一步,使用普氏叠印法(GPA,generalized procrustes analysis)对不同部位的长枝叶和不同部位的短枝叶进行分析,通过GPA分析可以得到一个样品平均形状的图像化结果。经过去除离群值,对数据进行提取和重新分类4。(3)统计分析根据上一步分析出来的叶片标志点数据,进行主成分分析(PCA,principal component analysis),通过PCA分析找出与叶片形态变化相关的几个主要因素,并且可以发现叶片形态变化的主要特征。1.2.2叶片解剖结
16、构从树体上采集6个不同处理的功能叶各3片,经FAA固定液处理后,根据石蜡制片法5制作永久切片。对每个切片选取3个视野,通过Motic B1Series System Microscope 软件进行拍照、观察并测量叶片厚度、上表皮厚度、下表皮厚度、栅栏组织厚度、海绵组织厚度和细胞结构紧实度(CTR,cell structure compactness)。将测得的数表1叶片标志点位置描述Table 1Description of leaf landmark标志点Landmark123456789101112描述Description叶片与叶柄的连接点叶片的顶端叶片轮廓上能代表叶尖程度的点(叶片左侧
17、)叶片轮廓上能代表叶尖程度的点(叶片右侧)叶片轮廓上能代表叶片最宽部位的端点(叶片左侧)叶片轮廓上能代表叶片最宽部位的端点(叶片右侧)紧接标志点5下边的凹陷点紧接标志点6下边的凹陷点能代表叶基部形状的点(叶片左侧),叶片基部第一个突出的点能代表叶基部形状的点(叶片右侧),叶片基部第一个突出的点能代表叶基部形状的点(叶片左侧),在标志点1和9之间能代表叶基部形状的点(叶片右侧),在标志点1和10之间8303 期毕楷杰等:银腺杨不同部位叶片形态、生理及转录差异分析据取平均值。CTR的计算公式如下:CTR=(栅栏组织厚度/叶片厚度)1001.2.3叶片色素含量测定从树体的同一方向上采集6个不同处理的
18、功能叶各3片,把叶片用蒸馏水洗净吸水纸擦干后,置于液氮中带回实验室,参照李合生6的方法测定叶片光合色素含量。在470、649和665 nm下用紫外分光光度计测定叶片的吸光度值(A470、A649、A665),计算出叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素的含量。计算公式如下:Ca=13.95 A665 6.88 A649Cb=24.96 A649 7.32 A665C类=(1000 A470 2.05 Ca 114.8 Cb)/245叶绿素含量=CVb/S 1000,其中,C 为各光合色素的浓度;S为叶片鲜重;V代表提取液总体积(10 mL);b为稀释倍数。1.2.4SOD、POD、CAT 酶活性及 M
19、DA 含量测定从树体的同一方向上采集6个不同处理的功能叶各3片,洗净擦干后用锡箔纸包好,放入液氮中保存,后期进行超氧化物歧化酶(SOD,superoxide dismutase)、过氧化物酶(POD,peroxidase)、过氧化氢酶(CAT,catalase)酶活性和丙二醛(MDA,malondialdehyde)含量的测定。测定方法参照李合生6的方法,采用紫外吸收法测定叶片中的CAT含量,采用氮蓝四唑法测定叶片中的SOD含量;采用愈创木酚法测定叶片中的POD含量;采用硫代巴比妥酸法测定叶片中的MDA含量。1.2.5营养元素含量测定从树体的同一方向上采集6个不同处理的功能叶各3片,洗净擦干后
20、用锡箔纸包好,放入液氮中保存,采用考马斯亮蓝法6测定可溶性蛋白含量,利用邹琦7的方法测定淀粉含量,采用国标法8-9测定粗脂肪和粗纤维含量。1.2.6内源激素含量测定从树体的同一方向上采集6个不同处理的功能叶各3片,经过剪碎混合后用于植物内源激素含量的测定。提取内源激素后使用Rigol L3000高效液相色谱仪对样品进行测定,色谱柱为Kromasil C18(250 mm4.6 mm,5 m)反相色谱柱,流动相为甲醇 1%乙酸水=4 6,进样量10 L,流速0.8 mL/min,柱温35,走样时间为40 min,紫外检测波长254 nm。1.2.7转录组测序分析从树体的同一方向上分别采集上部和下
21、部两个部位相对位置一致的长枝叶和短枝叶,每个处理采集3片,作为3次重复,将叶片清洗干净,吸水纸擦干后,用锡箔纸包好后放进液氮中,以备后期转录组测序。转录组测序分析主要包含以下步骤:(1)用植物总RNA提取试剂盒提 取 叶 片 中 的 总 RNA,随 后 用 NanoPhotometer spectrophotometer 和 Agilent2100 bioanalyzer 检 测RNA的纯度和完整性。(2)用带有Oligo(dT)的磁珠富集具有polyA尾巴的真核mRNA后,用超声波把mRNA打断。随后以片段化的mRNA为模版,随机寡核苷酸为引物,在M-MuLV逆转录酶体系中合成cDNA第一条
22、链,随后用RNaseH降解RNA链,并在DNA polymerase I 体系下,以 dNTPs 为原料合成cDNA第二条链。纯化后的双链cDNA经过末端修复、加A尾并连接测序接头,用AMPure XP beads筛选200bp左右的cDNA,进行PCR扩增并再次使用AMPure XP beads纯化PCR产物,最终获得文库。构建好的文库利用NanoPhotometer spectrophotometer和Agilent 2100 bioanalyzer检测RNA的纯度和完整性。(3)文库质检合格后,利用Illumina HiSeq2500平台进行测序,下机数据通过过滤掉低质量的数据,得到Cl
23、ean reads。本研究与NCBI版本的毛果杨基因组(Populus trichocarpa-NCBI-NLM(nih.gov)进行比对。(4)利用StringTie v1.3.1软件10进行转录本的重构,并利用RSEM11计算每个样本中基因的表达量,结果再以 FPKM 的形式表现出来。利用DESeq212软件筛选各比较组的显著差异显著基因,筛选的标准为:FDR1。(5)利用clusterProfiler(3.4.4)软件对筛选出的差异表达基因进行GO功能富集和KEGG通路富集分析。(6)根据转录组测序数据,从4个比较组中的植物激素信号转导途径中寻找与IAA和ABA有关的差异表达基标记点序号
24、同表1Number of leaf landmark is the same as Table 1图1标志点位置Fig.1Location of the landmark831植物遗传资源学报24 卷因,共10个差异表达基因进行RT-qPCR验证(其中上部长枝叶相对于上部短枝叶(SC-vs-SD)、下部长枝叶相对于下部短枝叶(XC-vs-XD)共有6个差异表达基因,上部长枝叶相对于下部长枝叶(SC-vs-XC)内有2个差异表达基因,上部短枝叶相对于下部短枝叶(SD-vs-XD)内有2个差异表达基因)。利用Primer 5.0软件设计每个基因的的特异性引物,内参基因为杨树18s ribosoma
25、l基因,每个基因的引物信息见表2。利用反转录试剂盒将每个样本的RNA反转录为cDNA,之后进行RT-qPCR试验。RT-qPCR试验用 2 M5 HiPer Realtime PCR Super mix with Low Rox(SYBRgreen,with anti-Taq)试剂盒,购于北京聚合美生物科技有限公司。试验扩增的体系为10 L 2 M5 HiPer Realtime PCR Super mix with Low Rox,上下游引物各0.5 L,1 L cDNA,8 LddH2O,共20 L,每个样品进行3次生物学重复。PCR反应条件为:95 30 s;95 变性15 s,退火15
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