壮通饮对脑缺血再灌注小鼠神经细胞损伤的影响及其作用机制.pdf
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1、2023年7 月第43卷第7 期Jul.2023 Vol.43 No.7本文引用:杨鑫勇,王凯华,刘丹宁,王亚南,周嫦艳.壮通饮对脑缺血再灌注小鼠神经细胞损伤的影响及其作用机制 ,湖南中医药大学学报,2 0 2 3,43(7):1155-116 4.湖南中医药大学学报Journal of Hunan University of Chinese Medicine1155壮通饮对脑缺血再灌注小鼠神经细胞损伤的影响及其作用机制杨鑫勇12,王凯华2*,刘丹宁1,2,王亚南1,2,周娣艳1,21.广西中医药大学研究生院,广西南宁530 2 0 0;2.广西中医药大学附属国际壮医医院,广西南宁530 2
2、0 0【摘要】目的探讨壮通饮对脑缺血再灌注小鼠神经细胞损伤的影响及其作用机制。方法采用线栓大脑中动脉栓塞法诱导建立小鼠脑缺血再灌注模型,造模成功后的6 7 周龄雄性C57BL6J小鼠随机分为模型组、壮通饮组、阿司匹林组、壮通饮联合阿司匹林组,各组再随机分为1、3、7 d时点组,另设不造模的空白组和假手术组,每组10 只,按照分组灌胃给药至相应时点。记录各组每日体质量及ZeaLonga评分,采用TTC染色法测定脑缺血小鼠的脑梗死体积百分比;HE染色观测缺血病理改变情况,TUNEL染色比较神经细胞凋亡情况,透射电镜观测神经细胞线粒体结构改变及自噬情况,Westernblot以及RT-PCR技术分析
3、P62、LC 3I/LC 3I、Bc 1-2/腺病毒E1B19kD相互作用蛋白3(Bc1-2/adenovirusE1B19kDa interacting protein3,BNIP3)-actin蛋白或基因表达情况。结果与空白组、假手术组相比,模型组体质量明显下降(P0.05),TTC染色可见脑组织缺血梗死,出现神经细胞凋亡及线粒体损伤。与模型组相比,各给药组体质量升高(P0.05),行为学评分降低(P0.05),梗死体积降低,且持续减小(P0.05);神经细胞凋亡率降低(P0.05)。模型组线粒体结构损伤明显较重,在1d时各给药组即可观测到较多线粒体自噬小体,而模型组在3d时才可观测到,在
4、7 d时各给药组大多数线粒体结构完整,可见被溶酶体消化完成的脂滴,而模型组可见自噬小体与自噬溶酶体同时存在。与模型组比较,各给药组P62蛋白表达在1d时降低,3、7 d时升高(P0.05);LC3II/LC 3I 的蛋白比值以及P62、BNI P3的基因表达水平在1d时升高,7 d时降低(P0.05)。在各给药组中,壮通饮联合阿司匹林组各项指标均优于其他给药组及模型组(P0.05)。结论壮通饮能够减轻脑缺血再灌注小鼠的神经细胞损伤,这可能与促进神经细胞发生线粒体自噬,维持细胞内线粒体稳态有关。【关键词】壮通饮;脑梗死;缺血再灌注;神经功能;线粒体自噬【中图分类号】R285.5【文献标志码 A【
5、文章编号 doi:10.3969/j.issn.1674-070X.2023.07.002Effects of Zhuangtong Drink on cerebral ischemia-reperfusion-inducednerve cell injury in mice and its mechanismYANG Xinyong2,WANG Kaihua*,LIU Danning,WANG Yanan,ZHOU Changyan?1.Graduate School,Guangxi University of Chinese Medicine,Nanning,Guangxi 530200,
6、China,2.International ZhuangMedicine Hospital of Guangxi University of Chinese Medicine,Nanning,Guangxi 530200,ChinaAbstract Objective To investigate the effects of Zhuangtong Drink on nerve cell injury induced by cerebral ischemia-reperfusion in mice and its mechanism.Methods The model of cerebral
7、ischemia-reperfusion in mice was established by threadembolism induced middle cerebral artery occlusion(MCAO).Six to seven-week-old male C57BL6J mice were randomly divided intomodel group and treatment groups including Zhuangtong Drink group,aspirin group and Zhuangtong Drink combined with aspiringr
8、oup after modeling.Each group was randomly subdivided into 1 d,3 d,and 7 d groups.In addition,blank group and sham-【收稿日期 2 0 2 3-0 4-14【基金项目】国家自然科学基金项目(8 19 6 0 8 0 1,8 2 16 0 9 46);广西中医药大学引进博士科研启动基金项目(2 0 18 BS063);广西一流学科建设开放课题(2 0 19 XK148);广西自然科学基金项目(2 0 2 1GXNSFAA196012);广西中医药大学第二批“岐黄工程 高层次人才团队培
9、育项目(2 0 2 10 0 8);广西壮族自治区中医药管理局自筹经费科研课题(GXZYZ20210103);广西中医脑病重点学科项目(GZXK-Z-20-14);广西中医药大学校级重点硕士研究生科研创新项目(YCSZ202030)。【第一作者 杨鑫勇,男,硕士,研究方向:脑血管疾病的中西医结合防治。【通信作者*王凯华,男,博士,主任医师,E-mail:Wa n g k a i h u a l 119 16 3.c o m。1156operated group without modeling were also set up,10 mice per group.The correspondi
10、ng drugs were administered by gavage in thegroups to the corresponding time points.The daily body weight and Zea Longa scores of each group were recorded,The percentageof cerebral infarction volume in mice with cerebral ischemia was measured by TTC staining;the ischemic pathological changes,neuronal
11、 apoptosis,and structural changes and autophagy of nerve cell mitochondria were observed by HE staining,TUNELstaining,and transmission electron microscope,respectively,the protein or gene expressions of P62,LC3 ILC3 I,Bel-2/adenovirusE1B 19kDa interacting protein3(BNIP3)and-actin were analyzed by We
12、stern blot and RT-PCR techniques.ResultsCompared with blank group and sham-operated group,the body weight of mice in model group decreased significantly(P0.05),andthe behavioral scores increased(P0.05);TTC staining showed cerebral ischemic infarction,neuronal apoptosis and mitochondrialinjury.Compar
13、ed with model group,the body weight of mice in treatment groups increased(P0.05);the behavioral scores,mortalityrates,as well as the rate of neuronal apoptosis decreased(P0.05);the infarction volume was reduced and continued to be lowered(P0.05).The structural damages of mitochondria in mice of mode
14、l group were obviously more severe More mitophagosomes could beobserved in treatment groups on the Ist day,while in model group on the 3rd day.Most of the mitochondria in treatment groupswere intact on the 7th day,and the lipid droplets digested by lysosomes could be seen,while in model group,autoph
15、agosomes andautolysosomes coexisted.Compared with model group,the expression of P62 protein in each treatment group decreased on the lstday and increased on the 3rd and 7th day(P0.05),while LC3 ILC3 I ratio and the gene expression levels of P62 and BNIP3increased on the lst day and decreased on the
16、3rd and 7th day(P005).Among treatment groups the indexes of Zhuangtong Drinkcombined with aspirin group were better than other treatment groups and model group(P0.05).Conclusion Zhuangtong Drink canrelieve the injury of nerve cells in cerebral ischemia-reperfusion mice,which may be related to the pr
17、omotion of nerve cellmitophagy and the maintenance of intracellular mitochondrial homeostasis.Keywords Zhuangtong Drink;cerebral infarction;ischemia-reperfusion;neurological function;mitophagy湖南中医药大学学报http:/2023年第43卷缺血性脑血管病是最常见的脑血管病,约占全部脑血管疾病的7 5%,具有高发病率、高死亡率、高致残率、高复发率等特点。目前,有效治疗方法包括溶栓治疗、血管内治疗等急性治疗措
18、施,但受到时间窗和出血转化风险的限制,且有缺血再灌注损伤的风险。因此,寻找有效的脑神经保护药物对保护缺血脑组织的功能具有十分重要的意义。壮医认为,头脑为“巧坞”,脑梗死是瘀血堵塞三道、两路,而致“巧坞”失养所致。治疗上,壮医注重疏三道通两路,调治“巧坞”。壮通饮由扶芳藤、黄花倒水莲、参三七3味特色壮药组成。扶芳藤味辛,性平,能通龙路、火路,能舒筋通络,止血消瘀。黄花倒水莲味甘,性微温,能祛湿解毒,补虚,活血止血。参三七味甘、温、微苦,能通龙路,能止血消肿,化瘀止痛。壮通饮有通龙路、火路之功,能舒筋通络、活血止血消瘀,在脑梗死的临床治疗上具有显著疗效 3。线粒体是缺血后神经细胞死亡的关键靶区,是
19、神经细胞存活的关键因素。线粒体自噬是一种特殊的自噬类型,可以选择性地清除受损线粒体,其在应激状态中(如缺氧、钙超载等)起着至关重要的作用4。在缺血再灌注病理过程中,细胞可以通过激活自噬途径,清除受损的线粒体和过量产生的活性氧化物(reactive oxygen species,R O S),维持细胞内线粒体功能的稳定,从而抑制线粒体依赖的调亡5。提示线粒体自噬是缺血再灌注病理过程中重要的内源性保护机制,是脑梗死治疗的潜在靶点。本研究通过动物实验,探索壮通饮与线粒体自噬的联系,以期为脑缺血治疗提供新思路及新药物。1材料1.1动物使用19 6 只SPF(specific pathogenfree)
20、级同遗传背景雄性C57BL6J小鼠,6 7 周龄,体质量19.421.4g,由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供,动物生产许可证号:SCXK(湘)2 0 19-0 0 0 4,动物质量合格证号:430 7 2 7 2 1110 12 5417 4。所有实验动物均饲养于广西中医药大学科学实验中心SPF级动物房中。饲养条件:5只1笼,温度2 2,湿度50%,自由饮水、进食,有实验人员操作时开启日光灯,其余时间关闭日光灯,于8:0 0 至17:0 0 开启动物照明灯光。本实验经本校伦理委员会批准,符合3R原则,伦理编号:DW20210410-074。本实验共使用小鼠19 6 只,死亡36 只,死亡原
21、因多为蛛网膜下腔出血及病情过重,实际纳人实验16 0 只,总体死亡率为18.37%。2023年第43卷1.2药物制备壮通饮方剂临床每日使用剂量:扶芳藤30 g,黄花倒水莲2 0 g,三七10 g。根据中药药理研究方法学提供的实验动物剂量换算方法,按照成人体质量6 0 kg计算,小鼠给药量:扶芳藤4.55g/(kg?d)、黄花倒水莲3.0 3g/(kgd)、参三七1.52 g/(kgd)。第一次煎煮取10 倍体积的纯水,浸泡30 min后,煮至沸腾后续煮1h,取溶液待用。第二次煎煮取8 倍体积纯水复煎,煮至沸腾后续煮30 min,取药液与第一次药液混合后使用30 0 目滤网过滤,将过滤后的药液至
22、于6 0 水浴锅中,浓缩药液至2 0 0 mL,每毫升含生药0.9 1g。按照0.1mL/10g灌胃体积灌胃给药。阿司匹林按照成人剂量10 0 mg/d(成人体质量按6 0 kg计算)换算成小鼠给药剂量为:13mg/kg,使用万分之一天平称取7.5mg每管分装于10 mL离心管中,每次给药前加人纯水5mL,每毫升含药1.5mg,制备成0.1mL/10g给药浓度的阿司匹林溶液。1.3主要仪器及试剂造模用线栓(型号:L1800)购自州佳灵生物技术有限公司。兽用青霉素钠(批号:19 0 30 1)购自华北制药集团有限责任公司。扶芳藤(批号:20210901)、黄花倒水莲(批号:2 0 2 1110
23、1)、三七(批号:2 0 2 10 7 0 1)购自仙茱中药科技有限公司。阿司匹林(批号:A104180)购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。戊巴比妥钠(批号:117 15)购自美国Sig-ma-Aldrich LLC.公司。TTC染液(批号:DK0005)购自北京雷根生物技术有限公司。Gluta电镜固定液(批号:P1126)、R IPA 强效裂解液(批号:R0010)、BCA蛋白浓度测定试剂盒(批号:PC0020)、脱脂奶粉(批号:D8340)均购自北京索莱宝科技有限公司。快速制胶试剂盒(批号:PG213)、三色预染蛋白maker(批号:WJ103)、超灵敏化学发光液(批号:SQ101)均购
24、自上海雅酶生物医药科技有限公司。LC3抗体(批号:146 0 0-1-AP)购自PTG。C y t C(批号:42 8 0 S)、-actin(批号:37 0 0 S)抗体购自美国CellSignaling Technology公司。P62抗体(批号:A7758)购自武汉博士德生物工程有限公司。羊抗兔二抗(批号:312 34)购自赛默飞世尔科技(中国)有限公湖南中医药大学学报http:/造模方法参考Zea Longa改良的线栓法对C57BL6J小鼠进行大脑中动脉缺血再灌注的造模。随机选择6 7 周龄实验小鼠,术前2 4h禁食不禁水,麻醉备皮后仰卧置于37 恒温垫上,于颈后垫一棉签以更好地暴露术
25、口,在摇臂显微镜下操作,正中切口,小心暴露左侧颈总动脉(common carotidartery,C C A),沿CCA向上继续分离颈外动脉(e x t e r n a l c a r o t i d a r t e r y,EC A)、颈内动脉(inter-nal carotid artery,I C A),术中注意避免触及迷走神经。两次结扎ECA后在结扎处中间剪断,使用动脉夹夹闭CCA和ICA,夹持住ECA残端,使用0.5mL注射器楔形面紧贴血管,与ECA上滑刺一小缺口,将线栓送人缺口处后,稍用力向外(以颈部正中为内)牵拉ECA残端,以避免线栓误人翼聘动脉(p t e r y g o p
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