小菜蛾清道夫受体基因家族鉴定与生物信息学分析_谭建彬.pdf
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1、收稿日期:2023-03-20基金项目:广东省基础与应用基础研究基金(2019A1515110745);广东省科技专项资金(2020A06013);广东海洋大学科研启动经费资助项目(R19025,R19029)作者简介:谭建彬(1994),男,在读硕士生,研究方向为害虫生物防治,E-mail:T通信作者:徐进(1984),男,博士,讲师,研究方向为害虫生物防治,E-mail:广东农业科学 2023,50(5):94-102Guangdong Agricultural Sciences DOI:10.16768/j.issn.1004-874X.2023.05.011谭建彬,徐进,师沛琼,周鸿凯
2、.小菜蛾清道夫受体基因家族鉴定与生物信息学分析J.广东农业科学,2023,50(5):94-102.小菜蛾清道夫受体基因家族鉴定与生物信息学分析谭建彬,徐 进,师沛琼,周鸿凯(广东海洋大学滨海农业学院,广东 湛江 524088)摘 要:【目的】小 菜蛾(Plutella xylostella)对化学杀虫性抗药性逐年上升,使 RNAi(RNA interference)农药广受关注。小菜蛾清道夫受体(Scavenger receptor,SR)在细胞免疫中表现出吞噬和清除病原体的能力,使其成为 RNAi 农药的备选靶标基因。为确定小菜蛾 SR 基因相关靶标,鉴定分析了小菜蛾 SR 基因家族成员信
3、息。【方法】基于全基因组数据,对小菜蛾 SR 基因家族的理化性质、跨膜结构、系统发育进化、蛋白质二三级结构预测、蛋白保守基序、磷酸化位点预测等内容进行分析。【结果】小菜蛾 SR 基因家族有 12 个 CD36 蛋白序列,具有相似的理化性质和功能结构,均含有多个亲水性和疏水性区域及 2 个跨膜螺旋区,蛋白质二、三级结构的主要特征为无规则卷曲,磷酸化位点中丝氨酸含量最高。小菜蛾与家蚕(Bombyx mori)、冈比亚按蚊(Anopheles gambiae)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)、烟草天蛾(Manduca sexta)、赤拟谷盗(Tribolium casta
4、neum)等 6 个物种共包含 117 条 CD36 蛋白序列,这些序列在进化树上分成 5 个分支,具有相似结构的基因聚为同一支,进化保守性强。小菜蛾 CD36px4、CD36px5 具有更复杂的三级结构,且 motif19、motif20 两个基序只存在 于 CD36px4,推测其在物种进化中发挥某些特异功能,CD36px4 磷酸化位点数量多达 143 个,可能与凋亡细胞的吞噬和清除功能表达有关。【结论】鉴定分析到 12 个小菜蛾 SR 蛋白均为跨膜型蛋白,且含有丰富的磷酸化位点,预测其可参与细胞内外物质传输、信号传递及能量代谢等机体活动,具有介导细胞凋亡、吞噬和清除凋亡细胞的功能,可作为
5、RNAi 农药的备选靶标,为小菜蛾 RNAi 农药靶标的筛选提供重要依据。关键词:小菜蛾;清道夫受体;基因家族;CD36;RNAi;功能结构中图分类号:S436.34 文献标志码:A 文章编号:1004-874X(2023)05-0094-09Genome-wide Identification and Bioinformatics Analysis of Scavenger Receptor Gene Family in Plutella xylostellaTAN Jianbin,XU Jin,SHI Peiqiong,ZHOU Hongkai(College of Coastal Agr
6、icultural Sciences,Guangdong Ocean University,Zhanjiang 524088,China)Abstract:【Objective】The resistance of Plutella xylostella to chemical insecticides is increasing year by year,which makes RNAi(RNA interference)pesticides widely concerned.The P.xylostella SR have phagocytic and pathogen-clearing a
7、bilities in cellular immunity,rendering them a promising target for RNAi pesticides.This study explores alternative targets for such pesticides by investigating the SR gene family in P.xylostella.【Method】Based on the P.xylostella genome,we comprehensively analyzed the physicochemical properties,tran
8、smembrane structure,phylogenetic evolution,secondary and tertiary structure prediction,conserved protein motifs and phosphorylation site prediction of SR gene family.【Result】The SR gene family of P.xylostella has 12 CD36 protein sequences with similar physicochemical properties and functional struct
9、ures,all of which contain multiple hydrophilic and hydrophobic regions as well as two transmembrane helical 95【研究意义】小菜蛾(Plutella xylostella)属鳞翅目菜蛾科,是一种严重危害十字花科蔬菜的世界性害虫,具有极强的繁殖潜力1-2。全球每年由小菜蛾造成的经济损失达 40 亿 50 亿美元,在我国造成的损失高达 7.7 亿美元3-4。长期使用广谱型化学杀虫剂对小菜蛾进行防治,使其已对包括苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)在内的大部分的杀虫剂产生
10、抗性5-7。在农药的“双减”政策下,寻找新型绿色环保的防治方法变得十分紧迫。RNAi 被称为“农业上又一次新的科技革命”,已应用于基因功能研究和害虫防治,其通过注入特定的双链 RNA 分子来抑制目标基因的表达,在鞘翅目、鳞翅目、半翅目等昆虫中取得了成功8,鉴定和分析小菜蛾清道夫受体(Scavenger receptor,SR)基因的功能对于开发有效的小菜蛾 RNAi 农药具有重要意义。通过这种方法,可以提高 RNAi 技术的效率和特异性,从而更好地防控小菜蛾,减少经济损失。【前人研究进展】SR 基因家族在凋亡细胞清理、机体免疫防御及感受信息素等生理过程中有着重要作用。细胞程序性死亡的关键步骤是
11、凋亡细胞的吞噬清除,这一过程对于维持体内环境平衡、免疫选择及组织形态和功能的重塑都至关重要。有研究将 CD36 包含在 B 类 SR 基因家族中进行分类,包括 CD36、LIMP 和 SR 家族 B(Scavenger receptor class B member,SCRBs),也有研究将其分为五大类。本研究将其分为 3 类,即 SCRBs、感 受 神 经 元 膜 蛋 白(Sensory neuron membrane proteins,SNMPs)以及 Croquemort(Catcher of death)9-10。在昆虫中,关于 CD36 的研究主要集中在果蝇和家蚕。果蝇的 CD36
12、基因主要有两种:一种是 Croquemort 基因,主要介导吞噬并在凋亡细胞的清除中发挥作用;另一种是 SNMP基因,主要控制昆虫触角的许多嗅觉感受神经表达。SNMPs 在昆虫中有广泛研究,尤其是在鳞翅目和双翅目昆虫中研究最为充分,其主要分为 SNMP1 和 SNMP2 两大亚家族,它们位于嗅觉神经元细胞树突末上,是引起嗅觉的重要元件,昆虫通过嗅觉来定位自身位置、寻找食物和居住地,并具有躲避天敌、趋避危险、交配和哺育后代等作用。在家蚕研究中,通过对家蚕全基因组的免疫研究鉴定分析了 13 个 SR-B 基因,证实了家蚕的黄茧基因 C(Yellow cocoon)是 SCRBs 家族的一个成员,编
13、码 Cameo2 蛋白,并且鉴定得到另一个与-胡萝卜素转运相关的蛋白11。然而,清道夫受体 B 类 I 基因(SRB)还能结合磷脂类物质,这一生理过程是巨噬细胞消除凋亡细胞的重要步骤,并且 SRB 还是模式识别受体,可识别多种不同的微生物结构物质,如 LPS(革兰氏阴性菌的细胞壁组成成分),在机体先天性免疫中发挥作用12-14。CD36 在机体抗真菌防御中也发挥作用,有研究证实小鼠中 CD36 结合 葡聚糖后利于抵抗新型隐球菌的感染。CD36 还可以作为信号传递分子结合钳合蛋白、胶原等,完整的 CD36 特异抗原等能够激活血小板,诱发单核细胞和血小板的突发性氧化作用。SR 也参与先天性宿主防御
14、细菌的感染,Stuart 等13研究发现,利用连续高通量 RNA 干涉方法筛选果蝇 SR 基因家族中 Croquemort 分支有特异性抑制不同菌的吞噬。此外,SR 基因家族还被指出可能参与脂质转移、脂蛋白代谢和类regions.Their secondary and tertiary structures feature irregular coiling with the highest serine content in the phosphorylation site.A total of six species,including P.xylostella,Bombyx mori,A
15、nopheles gambiae,Drosophila melanogaster,Manduca sexta and Tribolium castaneum contained 117 CD36 protein sequences that were classified into five distinct branches on the evolutionary tree.Genes with similar structures were grouped together within the same branch,indicating a high conservation thro
16、ughout evolution.CD36px4 and CD36px5 exhibit more intricate tertiary structures.The motif 19 and motif 20 are exclusive to CD36px4,suggesting their potential involvement in species evolution.With a staggering 143 phosphorylation sites,CD36px4 may play a crucial role in the phagocytosis and clearance
17、 of apoptotic cells.【Conclusion】The 12 SRs identified are transmembrane proteins with abundant phosphorylation sites,predicted to participate in various physiological processes such as intracellular and extracellular material transport,signal transduction,energy metabolism,and apoptosis regulation.T
18、hey also possess the functions of mediating phagocytosis and clearance of cellular debris.These receptors represent a promising target for RNAi-based pesticides.The results have provided a crucial foundation for the screening of RNAi pesticide targets.Key words:Plutella xylostella;scavenger receptor
19、;gene family;CD36;RNAi;functional structure 96胡萝卜素转运,这与其跨膜蛋白性质有关。因此,SR 基因家族是昆虫生存中重要的几个基因家族之一。【本研究切入点】RNAi 农药技术发展亟待解决的关键问题在于寻找绿色农药新靶标。目前国内大部分昆虫先天免疫研究都集中在体液免疫中,涉及抗菌肽的 PRRs、PGRPs、BGRPs 受体以及 Toll 等信号途径,这些途径都调控抗菌肽的表达和酚氧化酶活化的级联反应。SR 则是一类位于细胞表面的跨膜糖蛋白,通过识别病原相关分子模式(PAMPs)调控溶酶体对病原物进行吞噬和清除。然而,以 SR 为特异性靶标的 RNAi
20、 农药研究在国内外仍然是一个未开发的领域。【拟解决的关键问题】本研究采用生物信息学方法,从全基因组到蛋白质水平鉴定小菜蛾 SR 家族成员,并将小菜蛾 B 类清道夫受体基因家族同源蛋白分为 SCRBs、SNMPs、Croquemort 共 3 大类,填补小菜蛾 SR 家族成员信息空白,探究小菜蛾 SR 在天然免疫防御中的调控机制,为其功能研究及构建外源 dsRNA 抑制小菜蛾天然免疫的 虫生真菌工程提供基础,并为筛选害虫防治的绿色 RNAi 农药靶标提供数据支撑。1 材料与方法1.1 小菜蛾 SR 基因家族成员全基因组鉴定从 NCBI 数据库下载由单倍体(Flye)组装染色体水平的小菜蛾基因组、
21、所有蛋白序列、CDS 及注释文件(RefSeq:GCF_932276165.1),及其他 5 个物种的基因组文件和蛋白 pep 序列:家 蚕(RefSeq:GCF_014905235.1)、冈 比亚 按 蚊(RefSeq:GCF_000005575.2)、黑 腹 果蝇(RefSeq:GCF_000001215.4)、烟 草 天 蛾(RefSeq:GCF_014839805.1)、赤拟谷盗(RefSeq:GCF_000002335.3)。在 pfam 网 站(http:/pfam.xfam.org/)获 取CD36 HMM 模 型(隐 马 尔 可 夫 模 型),利 用hmmer v3.3.2 软
22、件(http:/hmmer.org/)以 CD36 结构域(PF01130)对小菜蛾基因组进行同源蛋白筛选,e-value 阈值小于 1E-20,将筛选得到的蛋白序列用 mafft v7.310(https:/mafft.cbrc.jp/alignment/software/)软件进行多序列比对15,使用默认参数,将利用 trimal v1.4.1(https:/ gap 区域的杂乱信号,以 trimal 后的文件构建新的 hmm 模型重新搜索小菜蛾基因组文件,新的筛选 e-value 阈值为小于 1E-3,得到 20 个 SR 家族成员蛋白。在 NCBI 搜索昆虫 SR 基因家族的氨基酸序列
23、构建 blast 数据库,利用 blastp v2.12.0(ftp:/ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/LATES)以构建的 blast 数据库搜索小菜蛾基因组的同源蛋白,筛选的 e-value 阈值为 1E-5,选取分数大于 70 分的蛋白序列,共得到 25 个蛋白序列。利 用 diamond v2.0.11(http:/ NCBI 网站上搜索昆虫的氨基酸序列构建数据库,筛选的 e-value 阈值为 1E-5,得到 27 个 SR 蛋白。取 3 种软件的蛋白序列去重得到 12 个小菜蛾 SR 基因家族的蛋白序列,依次按CD36px
24、1 CD36px12 命名。将上述鉴定的所有蛋白在 CDD(https:/www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi)、pfam 网 站 以 及 InterProScan(http:/www.ebi.ac.uk/interpro/)、SMART(http:/smart.embl-heidelberg.de/)上验证结构域。鉴定发现小菜蛾的 12 个 SR基因家族蛋白均含有 CD36 结构域。1.2 SR 基因家族疏水性、信号肽及跨膜螺旋区域分析运 用 ProtScale(https:/web.expasy.org/protscale/)进行
25、蛋白疏水性分析,运用 TMHMM(http:/www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM)、Phobius(https:/phobius.sbc.su.se/)预 测 蛋 白 质 跨 膜 螺 旋 区(Transmem-Branehelicalsegments,TMHs),通过ProtParam(http:/web.expasy.org/protparam/)分 析分子量和等电点(pI),信号肽通过 SignalP-5.0程序(http:/www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)进行预测。1.3 SR 基因家族系统进化树构建将小菜蛾、家蚕、冈比亚按蚊、黑腹
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