西瓜食酸菌Ⅲ型分泌效应物基因aop2功能分析_陈宝强.pdf
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1、研究报告生物技术通报BIOTECHNOLOGY BULLETIN2023,39(6):286-297收稿日期:2022-10-25基金项目:国家自然科学基金项目(31260419)作者简介:陈宝强,男,硕士,研究方向:植物病原细菌与植物互作机制;E-mail:通讯作者:刘君,女,博士,副教授,研究方向:植物病原细菌学;E-mail:;王希东,男,硕士,副教授,研究方向:植物分子生物学;E-mail:西瓜食酸菌 III 型分泌效应物基因 aop2 功能分析陈宝强 李莹莹 马博雅 肉扎古丽马利克 优丽图孜乃比 宋金迪 刘君 王希东(新疆农业大学生命科学学院,乌鲁木齐 830052)摘 要:III
2、型分泌效应物(type III secreted effectors,T3SEs)是细菌性果斑病(bacterial fruit blotch,BFB)的病原菌西瓜食酸菌(Acidovorax citrulli)分泌的关键致病因子。鉴定西瓜食酸菌特异的、具有 GNAT(Gcn5-related N-acetyltransferase)超家族结构域的 T3SE 基因 aop2,分析其编码蛋白质影响植物免疫的方式,可为深入认识该基因在病菌致病机制中的作用奠定基础。利用生物信息学分析其序列特征;借助荧光定量 PCR 技术分析 aop2 的表达调控及其表达与抗病相关基因表达间的关系;利用基因突变及基因
3、功能互补手段,通过分析致病性、寄主活性氧积累量等解析基因功能;使用瞬时表达技术了解 Aop2 抑制激发子诱导的细胞坏死能力及其亚细胞定位情况。aop2 基因启动子区存在 III 型分泌系统(type III secretion system,T3SS)核心基因结合位点,其编码的蛋白不存在信号肽和跨膜螺旋区,含一个 GNAT 家族乙酰转移酶结构域但无同源蛋白;T3SS 核心基因 hrpG/hrpX 突变体中 aop2基因的表达量显著降低;缺失 aop2 基因的突变体对寄主黄瓜的致病力降低,但黄瓜子叶中活性氧积累量增加;Aop2 可定位于烟草整个细胞,能够抑制由坏死因子 NIP 诱导的 PCD(p
4、rogrammed cell death);Aop2 的表达增强了烟草叶片中病原相关分子模式触发的免疫(PAMP-triggered immunity,PTI)信号通路,以及 SA 和 JA 信号通路相关基因的表达。结果表明,Aop2 为西瓜食酸菌一个含有 GNAT 结构域的特异 T3SE,其在与寄主黄瓜互作中发挥毒性因子功能,在与烟草互作中参与调控植物细胞死亡及 PTI 和植物激素相关抗病防卫反应。关键词:III 型分泌效应物;aop2;毒性因子;细胞死亡;乙酰转移酶;PTI;西瓜食酸菌DOI:10.13560/ki.biotech.bull.1985.2022-1303Functional
5、 Analysis of the Type III Secreted Effector Gene aop2 in Acidovorax citrulliCHEN Bao-qiang LI Ying-ying MA Bo-ya ROUZHAGULI Malike YOULITUZI Naibi SONG Jin-di LIU Jun WANG Xi-dong(College of Life Sciences,Xinjiang Agricultural University,Urumqi 830052)Abstract:Type III secreted effectors are the key
6、 pathogenic factors secreted by Acidovorax citrulli,the pathogen of bacterial fruit blotch(BFB).To identify the T3SE gene aop2 with GNAT(Gcn5-related N-acetyltransferase)superfamily domain,which is specific for Acidovorax citrulli,and to analyze the way that its encoded protein affects plant immunit
7、y,will lay a foundation for further understanding the role of this gene in pathogen pathogenesis.Bioinformatics was applied to analyze the sequence characteristics.Fluorescence quantitative PCR was used to analyze the expression regulation of aop2 and its relationship with the expression of disease-
8、resistant genes.Gene mutation and gene function complementation was to analyze the gene function,including pathogenicity and host reactive oxygen species accumulation.Transient expression technique was used to investigate the ability of Aop2 inhibitory elicitor to induce necrosis and its subcellular
9、 localization.There was a core gene binding site of Type III secretion system(T3SS)in the promoter region of aop2 gene,and there was no signal peptide or transmembrane 2023,39(6)287陈宝强等:西瓜食酸菌型分泌效应物基因 aop2 功能分析西瓜食酸菌(Acidovorax citrulli)是一种革兰氏阴性病原菌,可侵染西瓜、甜瓜等葫芦科植物的子叶、真叶、果实,出现水浸状病斑、果实腐烂等症状,导致瓜类的细菌性果斑病(b
10、acterial fruit blotch,BFB)1-2。BFB 目前已经在全球范围传播,给西甜瓜种植业造成了毁灭性的打击3。在葫芦科植物中尚未发现对 BFB 高抗的种质资源,加之化学药剂防治效果不佳,BFB 已严重制约着西甜瓜种植业的健康发展4。与许多革兰氏阴性病原菌相似,西瓜食酸菌可通过 III 型分泌系统(type III secretion system,T3SS)的针状结构将 III 型分泌效应物(type III secreted effectors,T3SEs)注射至宿主细胞内,T3SEs通过改变植物细胞代谢或抑制宿主免疫反应贡献毒力5。鉴定病菌的 T3SEs,分析其功能,可为
11、深入解析病原菌致病机理,进而为发掘防控 BFB 的新途径、新方法奠定基础。目前,对西瓜食酸菌 T3SEs的相关研究仍然非常有限。西瓜食酸菌 T3SEs 相关的研究陆续发现,亚群 II 菌株 Aac5 存在 hrpX 和 hrpG 的同源基因,这些基因是调控 T3SEs 表达的 T3SS 核心基因6,该研究结果为鉴定与分析西瓜食酸菌不同亚型菌株的 T3SEs 奠定了重要基础。Eckshtain 等7以亚群II 菌株 AAC00-1 基因组为基础,鉴定出 11 个同源T3SEs 基因。Jimnez-Guerrero 等8通过对亚群 I 菌株 M6 全基因组序列分析,预测到 51 个候选 T3SEs
12、基因,分析认为其中 7 个编码假定蛋白的基因可能为 Acidovorax 属独有的,对其中两个预测的 T3SEs进行了转运功能和亚细胞定位分析,而大量的预测蛋白尚未验证,功能未知。Zhang 等9鉴定到西瓜食酸菌 Aac5 中的同源效应蛋白 AopN,发现其可以诱导 Nicotiana benthamiana 叶片的 PCD 反应,此外,AopN 编码基因被敲除后,病原菌对本氏烟草的致病力显著减弱,这为西瓜食酸菌致病机制的进一步探究提供了新的认识。张晓晓10通过生物信息学分 析、效应蛋白与激发子共表达等实验,在亚群 II 菌株 Aac5 中获得了 4 个可信度较高的新型 T3SEs,验证了其中
13、的 Ace1 蛋白通过干扰寄主胼胝质沉积、ROS 爆发的方式影响植物免疫反应。杨琳琳11在西瓜食酸菌 Aac5 菌株中筛选到西瓜食酸菌特异T3SE Ace1242,其通过抑制 PTI 发挥毒性。上述研究表明,西瓜食酸菌中已发掘出部分候选 T3SEs,其中一些与已知的 T3SEs 同源,但它们的功能和在寄主中的作用机制尚不清楚。同时,在西瓜食酸菌中存在新型或特异的 T3SEs 有待深入研究,这对认识西瓜食酸菌与寄主互作机制具有重要意义。研究发现,病原菌可以通过影响植物生理生化过程发挥毒性,例如 Phytophthora parasitica 通过抑制植物组蛋白乙酰化修饰而逃避植物免疫12,显示组
14、蛋白乙酰化作为植物蛋白翻译后修饰的重要方式在病菌侵染植物过程中起到重要作用。研究团队前期在西瓜食酸菌 I 型菌株 FC440 的基因组中,发现一个注释为假定蛋白、序列中含 GNAT(Gcn5-related N-acetyltransferase)保守结构域的候选效应物基因,本研究将其命名为 aop2。GNAT 超家族是真核生物组蛋白乙酰转移酶的五大家族之一13,在植物中研究得较多,但迄今未见病原菌 T3SE 中有属于 GNAT家族蛋白的报道,其特点和参与调控寄主的免疫反应的方式也尚不明确。本研究通过对具有 GNAT乙酰转移酶结构域、西瓜食酸菌潜在的特异 T3SE(Aop2)进行功能分析,为后
15、续深入解析其作用机制奠定重要基础,同时也为西瓜食酸菌防治措施的制定提供理论依据。helical region in the encoded protein,and there was a GNAT family acetyltransferase domain but no homologous protein.The expression of aop2 gene in hrpG/hrpX mutant of T3SS significantly decreased.The mutant with aop2 gene deletion decreased the pathogenicity
16、of host cucumber,but increased the accumulation of reactive oxygen species in cucumber cotyledon.Aop2 can be localized to whole tobacco cells and inhibited programmed cell death(PCD)induced by NIP.The expression of Aop2 enhanced the expression of genes involved in SA and JA signaling pathways trigge
17、red by pathogen-related molecular patterns in tobacco leaves.The results showed that Aop2 was a specific T3SE containing GNAT domain in A.citrulli.Aop2 played the function of virulence factor in the interaction with cucumber and was involved in the regulation of plant cell death and PTI and phytohor
18、mone-related disease resistance in the interaction with tobacco.Keywords:type III secreted effectors;aop2;virulence factor;cell death;acetyltransferase;PTI;Acidovorax citrulli生物技术通报 Biotechnology Bulletin2023,Vol.39,No.62881 材料与方法 1.1 材料1.1.1 植物材料 品种为长春密刺的黄瓜(Cu-cumis sativus)和本氏烟草(Nicotiana benthami
19、ana)。植物培养于 28/25、16 h/8 h 明暗交替条件下,其中黄瓜于栽培 5 d 时使用,烟草于培养 30-45 d使用。1.1.2 菌株、质粒及引物 本研究中所用的菌株、质粒见表 1,引物见表 2。1.1.3 主要试剂与仪器 本研究中抗生素购自北京索莱宝科技有限公司;限制性内切酶、rTaq 酶和PrimeSTAR HS DNA Polymerase 购自宝生物工程(大连)有限公司;化学试剂购自国药集团;TransZol Up Plus RNA Kit、EasyScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix、Trans
20、Start Green qPCR SuperMix 购自北京全式金生物;ClonExpress II One Step Cloning Kit 购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司;激光共聚焦显微镜为 ZEISS 公司;荧光定量 PCR 仪为 Roche 公司。1.1.4 培养基及培养条件 大肠杆菌 TransT1、农杆菌 GV3101 和西瓜食酸菌 FC440 培养条件及培养基,以及注射缓冲液配制分别参考相关文献14,其中LB 液体培养基中添加 10 mmol/L MgCl2即为 T3SS 诱导培养基。本研究中使用的抗生素浓度:西瓜食酸表 1 供试菌株、质粒Table 1 Bacterial
21、strains,plasmids used in this study菌株和质粒 Strain and plasmid 名称 Name特性 Characteristic来源 Source菌株 StrainFC440(WT)AmpR;wild typeOur laboratoryFC440(aop2)AmpR;KanR;FC440 mutant defective in aop2This studyFC440(aop2-aop2)AmpR;KanR;GmR;FC440(aop2)complemented with the fragment of aop2 gene expressed by ve
22、ctor pBBR1MCS-5This studyFC440(hrpG)AmpR;KanR;FC440 mutant defective in hrpG14FC440(hrpX)AmpR;KanR;FC440 mutant defective in hrpX14Trans T1(pBBR1MCS-5-aop2)GmR;E.coli TransT1 strain containing vector pBBR1MCS-5-aop2 This studyS17-1(pBBR1MCS-5-aop2)GmR;E.coli S17-1 strain containing vector pBBR1MCS-5
23、aop2This studyGV3101RifR;wild typeOur laboratoryGV3101(pAPK-aop2)SpecR;RifR;GmR;GV3101 strain containing vector pAPK-aop2This studyGV3101(pAPK-GFP)SpecR;RifR;GmR;GV3101 strain containing vector pAPK-GFP15GV3101(pBINGFP2-aop2)KanR;RifR;GmR;GV3101 strain containing vector pBINGFP2-aop2This studyGV3101
24、(pBINGFP2)SpecR;RifR;GmR;GV3101 strain containing vector pBINGFP215GV3101(BAX)KanR;RifR;GmR;GV3101 strain containing BAX15GV3101(NIP)KanR;RifR;GmR;GV3101 strain containing NEP15GV3101(NIP)KanR;RifR;GmR;GV3101 strain containing NEP15GV3101(Avh241)KanR;RifR;GmR;GV3101 strain containing Avh24115GV3101(
25、INF1)KanR;RifR;GmR;GV3101 strain containing INF115质粒 PlasmidpMD19-TAmpR;Cloning vectorTaKaRapMD19-T-aop2AmpR;pMD19-T vector containing a 438-bp fragment with the aop2 gene This studypK19mob2HMB-aop2KanR;pK19mob2HMB vector containing a 301-bp fragment with the aop2 geneThis studypBBR1MCS-5-aop2GmR;pB
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