饲料中添加亮氨酸和谷氨酰胺.鲆幼鱼生长和肠道健康的影响_仲茜.pdf
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1、为研究在植物蛋白源替代部分鱼粉的饲料中添加晶体或小肽形式的亮氨酸或和谷氨酰胺对大菱鲆幼鱼的生长性能、血浆代谢及免疫指标、肠道组织形态和 通路基因表达的影响,实验设计了组等氮等能饲料:全鱼粉组(),阴性对照组(,以植物蛋白源替代 组中 的鱼粉),在 组的基础上添加 晶体 的组,添加 晶体 的 组,添加晶体 和晶体 ()的 组,以及添加 二肽的组。选取初始体质量()的大菱鲆幼鱼,进行为期周的养殖实验。研究表明,与单独添加 和 相比,共同添加 和 能更显著地提高大菱鲆幼鱼的终末体质量、特定生长率、蛋白质沉积率和脂肪沉积率,且这些指标均与组差异不显著()。组和组的血清 含量高于 组,且与 组无显著差异
2、()。相比 组,和 共同添加可显著提高大菱鲆幼鱼的血清溶菌酶活性()。此外,和 共同添加时,大菱鲆幼鱼的肠绒毛高度显著高于 组(),且组的肠道杯状细胞数量显著高于 组()。和 共同添加可提高大菱鲆幼鱼肠道 基因的表达水平,且组的肠道 基因表达水平显著高于 组();组的肠道 基因表达水平显著高于 组()。研究结果表明,在植物蛋白源替代鱼粉的饲料中添加 和 ,可以提高鱼体生长性能、饲料利用和免疫力,改善肠道健康状态,并能够通过上调 通路的基因表达来调节肠道细胞分化,且 和 共同添加(在 的添加量下)效果优于单一添加。关键词:氨基酸;饲料添加剂;交互作用;大菱鲆;二肽;鱼粉替代;肠道形态结构;信号通
3、路中图法分类号:文献标志码:文章编号:():引用格式:仲茜,许丹丹,王旋,等饲料中添加亮氨酸和谷氨酰胺对大菱鲆幼鱼生长和肠道健康的影响中国海洋大学学报(自然科学版),():,(),():*基金项目:国家重点研究发展计划项目();国家现代农业产业技术体系项目()资助 ();()收稿日期:;修订日期:作者简介:仲茜(),女,硕士生。:*通讯作者:营养学研究发现,在动物快速生长期,氨基酸对机体饲料利用、蛋白质沉积、组织功能完整性和免疫功能有着重要作用。氨基酸是生物体合成蛋白质的前体物质,且具有许多重要的生理功能。目前已有许多研究报道了饲料氨基酸添加剂对于鱼类生理功能的影响,其在水产养殖业中具有广阔的
4、应用前景。其中,亮氨酸()是一种鱼体不能自身合成的必需氨基酸,也是二十种氨基酸中唯一的生酮氨基酸。是激活雷帕霉素靶蛋白()信号通路效果最好的氨基酸,有着起始蛋白质翻译过程的功能;缺乏会减缓蛋白质合成,并引起脂肪代谢紊乱的问题。当饲料配方中鱼粉被其他蛋白源替代时,鱼类对 的利用率通常较低,因此需要添加晶体 以满足其营养需求。有报道称,饲料中适宜水平的 可以提高鱼类的生长性能和免疫力。谷氨酰胺()是动物体内含量最多的游离氨基酸,也是一种条件性必需氨基酸。是鱼类组织的主要代谢燃料,在蛋白质合成和抗氧化反应中发挥着重要作用。有研究表明,饲料中添加 能够改善鱼类的生长性能、免疫力和肠道健康 。目前含有高
5、水平植物蛋白源的饲料通常会诱发鱼类的炎症性肠病 ,因此,鱼类对饲料中营养物质的利用率与鱼类肠道健康的关系受到广泛关注。期仲茜,等:饲料中添加亮氨酸和谷氨酰胺对大菱鲆幼鱼生长和肠道健康的影响在动物体内,不同氨基酸之间存在相互协同或拮抗的作用,这种氨基酸的交互作用受到多种因素的影响,包括氨基酸本身的性质、动物的生理状态和种类等。目前在鱼类上关于氨基酸交互作用的研究较少。在哺乳动物上的研究表明,通过双向转运机制,可以促进 的吸收,因此 浓度能够限制 生长因子激活 信号通路,从而限制蛋白质合成和细胞增殖。此外,叶元土等在草鱼肠道离体灌注模型上的研究表明,能够显著增加草鱼肠道对 的吸收量和肠道组织内的游
6、离 含量,且能够显著增加草鱼肠道的蛋白质合成代谢。因此,在饲料中联合添加 和 可能提高鱼类的氨基酸的利用率和生长性能,从而取得更好的养殖生产效果。虽然大量研究表明在鱼类饲料中单独添加 、等氨基酸具有促进生长、提高免疫力的作用,但未见有鱼类饲料中联合添加 和 的报道。需要注意的是,动物摄食的蛋白质被消化后会以氨基酸或小肽的形式被动物吸收,而肠道小肽转运载体的转运效率远高于氨基酸转运载体。有研究推测大菱鲆()偏好以小肽的形式吸收蛋白质。此外,硬骨鱼可以有效地利用小肽进行发育、生长和新陈代谢。同时,由于晶体氨基酸的稳定较差,因此在饲料生产中,常用二肽替代晶体氨基酸。例如用于替代饲料中晶体 的 和 ,
7、在被动物摄取后能够快速水解释放单体 ,以更高效地发挥调节营养代谢的作用。基于此,本实验补充设计了添加 二肽的处理组,来观察不同氨基酸添加模式(晶体或小肽)对鱼类生理状态的调节效果。大菱鲆是着国重要的海水养殖鱼类,本研究以大菱鲆为研究对象,旨在探究复合植物蛋白源替代部分鱼粉后,饲料中单独或共同添加 与 及其不同联合添加模式(晶体氨基酸或小肽)对大菱鲆幼鱼的生长性能、血浆代谢指标、肠道健康和免疫力的影响,进而揭示 和 在鱼类饲料中的最佳组合模式。本研究的成果能够为饲料配方设计和生产中氨基酸的添加提供理论依据与应用指导,同时也能为氨基酸型饲料添加剂的开发提供新的思路和参考。材料与方法实验饲料配方设计
8、与制作设计组等氮等能饲料,以鱼粉、豆粕、花生粕、谷朊粉为主要蛋白源,以鱼油为主要脂肪源。主要蛋白源仅鱼粉的饲料为全鱼粉组(),以复合植物蛋白替代 鱼粉的饲料为阴性对照组(),在 组的基础上分别添加 的晶体 、晶体 、晶体 和晶体 的混合物()、二肽,形成四个处理组(分别记为、组)。添加晶体氨基酸(、和 )以维持这组实验饲料的氮平衡,配制颗粒饲料的方法参照文献 ,制粒前调节饲料 至中性,实验饲料配方及近似组成如表所示。养殖管理与样品采集养殖实验开始前,选取健康的大菱鲆幼鱼(购自当地养殖场),在室内循环水养殖系统中(黄海水产公司养殖基地,山东海阳)投喂商业饲料暂养周,驯化以适应养殖环境。养殖实验开
9、始前,取尾大菱鲆用于测定初始全鱼体组成成分,保存于 冰箱中。挑选规格均一、体格健壮的大菱鲆幼鱼(),随机分到 个养殖桶中,每桶 尾鱼,每个处理个重复桶,每天:和:表观饱食投喂次实验饲料,进行为期周的养殖实验。养殖所用海水为浅井海水,经过二级沉淀、砂滤后,以约 的流速进入养殖桶中。养殖实验期间,维持水温 ,盐度 ,溶解氧,为 ,氨氮和亚硝酸盐 。养殖周期结束时,所有实验鱼禁食以使代谢状态达到一致。在禁食 时称重并计数,用于计算生长指标和存活率;在禁食 时再饱食投喂相应的各组实验饲料。每个处理组随机取尾全鱼用于体组成分析,保存于 冰箱中待用;每个处理组另取尾鱼的完整肠道用于组织切片分析,使用生理盐
10、水漂洗后置于 固定液中待用。在复投喂后随机取尾鱼的血浆样品用于血浆生理指标分析,离心后取上清保存于 冰箱中待用;同时取肠道组织用于实时荧光定量 分析(),在液氮中速冻后保存于 冰箱中待用。体组成成分分析全鱼体组成成分分析方法参见文献 。简而言之,将大菱鲆全鱼放置于 烘箱中烘干 至恒重并称量,计算全鱼水分含量;使用全自动凯氏定氮仪(,)测定大菱鲆全鱼粗蛋白,用索氏抽提法(以石油醚为溶剂)测定全鱼粗脂肪;使用 马弗炉高温灼烧样品,称重并计算全鱼灰分含量。血清生理生化及免疫指标分析使用全自动生化分析仪(,)检测并分析大菱鲆幼鱼的血清葡萄糖、总胆固醇、甘油三酯以及血浆总蛋白的含量,检测所需试剂购自 公
11、司。依据制造商的说明书,使用南京建成试剂盒检测大菱鲆的血清溶菌酶活性。中国海洋大学学报 年表饲料配方及干物质中组成成分 项目 组别 原料(干物质)()鱼粉 豆粕 花生粕 谷朊粉 小麦粉 鱼油 磷酸二氢钙 晶体蛋氨酸 晶体赖氨酸 晶体甘氨酸 其他成分 晶体亮氨酸 晶体谷氨酰胺 亮氨酸谷氨酰胺二肽 合计 基本成分 粗蛋白 粗脂肪 灰分 能量 ()注:全鱼粉组;:阴性对照组(以植物蛋白替代组中 的鱼粉)。、组分别在 组的基础上分别添加 的晶体 、晶体 、晶体 和晶体 混合物、二肽。下表,下图同。:其他成分:矿物质混合物,维生素混合物,氯化胆碱 ,防霉剂 ,抗氧化剂 ,诱食剂。:;:(),:,肠道组织
12、形态将固定好的大菱鲆幼鱼肠道组织取出,选取每尾鱼的相同部位,经过乙醇脱水后置于二甲苯中,然后用融化的石蜡包埋肠道组织,冷却后切片。使用全自动染色机进行 染色后,封片并拍摄显微镜下观察到的肠道形态,使用 软件定量分析肠绒毛高度及肠道杯状细胞数目。实时荧光定量 使用 试剂(,)裂解大菱鲆 肠 道 组 织,依 照 制 造 商 的 说 明 书 提 取 组 织,通过琼脂糖凝胶电泳检测 质量,使用微量 分 光 光 度 计(,)检测 的质量及浓度。使用反转录试剂 盒 (,)合成大菱鲆肠道组织的;使用实时荧光定量 仪(,)对大菱鲆肠道分化相关基因 、的 相对表达量进行 测 定 和 分 析,以 作 为 内 参
13、基 因。本研究中实时荧光定量 ()所使用的引物见表。期仲茜,等:饲料中添加亮氨酸和谷氨酰胺对大菱鲆幼鱼生长和肠道健康的影响表 所用引物序列 基因名称 上游引物 下游引物 扩增长度 统计分析与计算采用 版软件对所得数据进行数据统计和分析,先对数据作单因素方差分析(),若处理间有显著差异,再使用 法进行多重比较,表示差异性显著。实验数据用平 均值标准差()表示。本研究所使用的计算公式如下:特定生长率(,)(终末体质量()初始体质量()养殖天数();摄食率(,)总摄食量()(终末体质量()初始体质量()养殖天数();存活率(,)终末尾数初始尾数 ;饲料系数(,)总摄食量()总增加质量();蛋白质效率
14、(,)鱼体增加质量()蛋白质摄入量();蛋白质沉积率(,)鱼体蛋白质增加质量()蛋白质摄入量();脂肪沉积率(,)鱼体脂肪增加质量()脂肪摄入量();肥满度(,)鱼体质量()(鱼体长度();脏体比(,)内脏团质量()全鱼质量();肝体 比(,)肝 脏 质量()全鱼质量()。结果生长性能与饲料利用饲料中单独或协同添加 、对大菱鲆幼鱼生长性能和饲料利用的影响如表所示。相比组,组大菱鲆幼鱼的 和 均显著降低(),组和 组的 和 显著高于 组(),且 与 组 无 显 著 差 异()。各组间 和 的差异不显著()。表饲料中添加 和 对大菱鲆生长性能和饲料利用的影响 项目 组别 终末体质量 特定生长率 (
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