坛紫菜丝状体不同诱变方法的比较研究.pdf
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1、为建立一种新型高效诱变坛紫菜自由丝状体的方法,对Co-射线、甲基磺酸乙酯(EMS)、紫外线(UV)处理的单因子诱变方法与Co-射线-UV(36W,35cm)、Co-射线-EMS处理的双因子诱变方法进行比较,观测丝状体的细胞形态、致死率、突变率、F/F的变化。结果表明,以突变率和半致死剂量为筛选标准,单因子最佳诱变条件分别为辐射剂量为10 0 0 Gy的Co-射线、0.1molL-的EMS处理2 h、36WUV照射18 0 min,最高突变率分别为0.0 2 4%、0.0 2 5%、0.0 32%。双因子最佳诱变条件为10 0 0 Gy的Co-射线和UV照射18 0 min、10 0 0 G y
2、 的Co-射线和0.1molL-的EMS处理2 h,最高突变率分别为0.0 8 2%和0.0 6 0%。此外,在观察和培养突变体2 1d后,Co-射线、EMS、U VCo-射线-UV和Co-射线-EMS的最高突变率分别下降至0.0 13%、0.0 11%、0.0 14%、0.0 40%和0.0 2 3%,表明辐射剂量为1000Gy的Co-射线和UV照射18 0 min的双因子诱变方式能得到较高的突变率,是新型高效的双因子诱变方法。本研究结果为坛紫菜自由丝状体突变体的分离纯化和基础研究提供了材料,同时为坛紫菜诱变育种研究提供了参考。关键词:坛紫菜;丝状体;单因子诱变;双因子诱变;突变率D0I:1
3、0.11869/j.issn.1000-8551.2023.08.1507在传统的紫菜养殖过程中,伴随着品种退化、产量质量下降、多发病害等问题。紫菜的优良品种对其产业的发展起着重要作用,而培育新品种的基础是种质资源。因此,加强紫菜优质种质资源的培育对坛紫菜产业的可持续发展具有重要意义。其中,辐射诱变能诱导新种质和新材料、增加突变频率、缩短育种周期、丰富突变类型,是品种改良的重要途径2-3。目前,关于作物的辐射敏感性4-5、辐射生物学效应6-7 和分子细胞生物学变异已有相关研究报道。辐射诱变育种已广泛应用于种质的创新。如陈竞天等8 利用Co-射线辐射甜叶菊,获得了综合性状优良的耐盐突变体材料。各
4、类诱变育种技术已广泛应用于紫菜中,成为提高育种效率、获得优良紫菜种质的主要手段。赵爽等9 用紫外线(ultraviolet,U V)诱导圆紫菜(Py r o p i a s u b o r b i c u l a t a)野生型叶状体,分离到了可稳定遗传的色素突变体。张倩等10 研究发现紫外线对皱紫菜(Pyropiacrispata)叶状体具有良好的诱变效果,成功分离出了四个皱紫菜的色素突变品系。Ding等1利用Co-射线诱变条斑紫菜(Pyropiayezoensis),筛选出了耐高温、光合色素含量高、孢子产量高的突变株ST-2。双因子诱变可以扩大突变的类型、增加突变谱,诱变处理的顺序发生改变
5、,获得的基因类型也随之改变,因此双因子诱变往往更有利于筛选出有利突变藻株12 ,双因子诱变方式在微藻和农作物中广泛使用13,如谢凤行等14 采用甲基磺酸乙酯(e t h y l m e t h a n e s u l f o n a t e,EM S)-紫外复合诱变技术选育出了蛋白含量高且生长较快的小球藻(Chlorellasorokiniana)突变株H10,但目前坛紫菜的诱变方式主要聚焦于单因子诱变选育出具有良好生产性能的突变株、利用环境条件(如高温)筛选出具有抗逆性的突变株,关于坛紫菜自由丝状体有高突变率的诱变方法组合鲜见报道。坛紫菜(Neoporphyrahaitanensis)浙东1
6、号为群体选育的品种(国家水产新品种证书编号:GS-01-013-2014),具有壳孢子放散量高、叶片厚、产量高的优势15。本试验通过对坛紫菜浙东1号的自由丝状体进行3种单因子和2 种双因子诱变处理,比较不同诱变方式的效果,以期筛选出合适有效的诱变方法,为坛紫菜收稿日期:2 0 2 2-10-2 7 接受日期:2 0 2 2-12-2 7基金项目:国家重点研发计划(2 0 18 YFD0901506-2),宁波市重大科技项目(2 0 2 1ZDYF020081)作者简介:秦欣,女,主要从事海洋生物研究。E-mail:1447 2 6 6 7 95 q q.c o m*通讯作者:骆其君,男,教授,
7、主要从事海藻栽培研究。E-mail:l u o q i j u n n b u.e d u.c n150837卷报农学核遗传育种提供技术参考。1材料与方法1.1材料与试剂坛紫菜浙东1号(ZD-1)自由丝状体来源于浙江省海洋生物技术重点实验室,藻体颜色正常,形态良好。甲基磺酸乙酯(EMS)、五水合硫代硫酸钠,购自中国上海国药化工有限公司。1.2仪器与设备EclipseTi倒置荧光显微镜,尼康仪器(上海)有限公司;手持搅拌料理棒,飞利浦家电(中国)投资有限公司;GXZ型智能光照培养箱,宁波江南仪器厂;WATER-PAM叶绿素荧光仪,德国Walz公司;TUVPL-L36W/4P紫外线杀菌灯,上海赖氏
8、电子科技有限公司。1.3试验方法1.3.1丝状体的诱变1.3.1.160Co-射线单因子诱变于浙江辐照中心(浙江省农业科学院作物与核技术利用研究所)进行6 Co-射线辐射处理,辐射后的丝状体参照文献16的方法培养。用手持搅拌料理棒将丝状体打碎,并用6 0 目筛绢过滤,得到长度为10 0 30 0 m的藻丝,在黑暗条件下恢复1d,对材料进行前处理。用0、50、125、40 0、10 0 0、16 0 0 G y 剂量的Co-射线进行诱变,诱变时间为30 min,处理后的藻丝使用灭菌海水清洗3次,再转人灭菌海水培养液中,培养条件为温度2 5,光照强度18 molm.s,光周期为光照:黑暗=12 h
9、:12h,培养时间为2 个月,每个试验组设置5个重复1.3.1.2UV单因子诱变将丝状体放人开盖的培养皿中,置于36 W紫外灯垂直距离为35cm处,照射30、60、18 0、36 0 m i n,以不做UV处理的丝状体作为对照,诱变后的藻丝处理与培养同1.3.1.1。1.3.1.3EMS单因子诱变前期通过预试验,确定2h为EMS诱变效果较好的处理时间。将藻丝用0.1、0.2、0.4mo l L-的EMS在4黑暗条件下浸泡2 h,以黑暗条件下浸泡在自然海水中的丝状体作为对照,诱变后的藻丝处理与培养同1.3.1.1。1.3.1.46Co-UV双因子诱变将Co-射线辐射组丝状体预培养2 个月,对材料
10、进行前处理后进行UV诱变,UV诱变方法同1.3.1.2。1.3.1.56Co-EMS双因子诱变将Co-射线辐射组丝状体预培养2 个月,对材料进行前处理后进行EMS诱变,EMS诱变方法同1.3.1.3。1.3.2形态观察取经过诱变处理的丝状体,用0.1%埃文斯蓝染色液避光染色15min,进行漂洗,置于倒置荧光显微镜下观察。将出现色泽变异和具有生长优势(长度大于50 0 m)的藻丝确定为突变藻丝。1.3.3致死率和突变率的计算以致死率达到50%(半致死率)作为诱变丝状体的适宜条件17-18 ,致死率和突变率的计算公式如下:丝状体致死率=已染色自由丝状体数目/被镜检的自由丝状体总数10 0%;突变率
11、=突变藻丝数量/非突变型藻丝存活数量+突变型藻丝存活数量)10 0%。1.3.4叶绿素荧光参数的测定取诱变处理组的丝状体,用吸水纸吸取多余水分后置于培养皿中,用叶绿素荧光仪测定光系统I(p h o t o s y s t e m I,PSI)的最大光化学量子产量(maximal photochemical quantumyieldof PSI,F,/F,),测定方法参考文献19。1.4数据处理采用Excel2007进行数据处理,用SPSS20.0软件进行相关性分析,Origin2018软件绘图,显著水平为P0.05。2结果与分析2.16Co-射线单因子诱变2.1.166Co-射线对形态的影响与
12、未辐射组(图1-a)相比,50 Gy(图1-b)、12 5G y(图1-c)、40 0 G y(图1-d)、10 0 0 G y(图1-e)辐射组营养藻丝的色素片弥散,分枝顶端的细胞体积开始变大,呈纺锤形或其他不规则形状,色素体由片状变为弥散状,继而呈颗粒状。说明50、12 5、40 0、10 0 0 Gy的辐射剂量促进了这些藻丝的发育和成熟,16 0 0 Gy(图1-f)辐射组可见较成熟的孢子囊枝,说明16 0 0 Gy的辐射剂量促进了营养藻丝转向孢子囊枝的生长。由此可见,6 Co-射线辐射处理可以促进自由丝状体的生长发育。2.1.260Co-射线对致死率和突变率的影响由图2可知,ZD-1在
13、不同剂量的Co-射线辐射下,都出现了突变的藻丝,在最低剂量50 Gy处理下,ZD-1的致死率为17.2%,突变率为0.0 0 2%,随着辐射剂量的增加,坛紫菜自由丝状体ZD-1的突变率呈现先上升后下降的趋势,致死率呈现逐渐上升的趋势,在10 0 0 Gy时,突变率到达峰值,为0.0 2 4%,致死率为49.3%,接近半致死率。综合致死率和突变率的结果,初步判定采用1000Gy剂量Co-射线进行诱变处理是最有利于筛选出突变体的辐射剂量。1509坛紫菜丝状体不同诱变方法的比较研究8期a50um50um50umd50um50um注:a:0 Gy;b:50 Gy;c:125 Gy;d:400 Gy;e
14、:1 000 Gy;f:1600 GyoNote:a:0 Gy.b:50 Gy.c:125 Gy.d:400 Gy.e:1 000 Gy.f:1 600 Gy.图1自由丝状体辐射诱变后的形态Fig.1Morphology after free-living conchocelis radiation mutagenesis90一致死率0.03080+突变率700.025600.020500.01540300.010200.00510005012540010001600辐射剂量Radiationdosage/Gy图26Co-射线诱变对坛紫菜ZD-1致死率及突变率的影响Fig.2Effect of
15、 Co-ray mutagenesis on the lethality andmutation rate of N.haitanensis ZD-12.1.360Co-射线对F,/F的影响由图3可知,随着辐射剂量的增加,ZD-1的F/F呈现先上升后逐渐下降的趋势。与未辐射组相比,当辐射剂量达到50 Gy时,ZD-1的F/F极显著升高(P0.01),当辐射剂量达到10 0 0 Gy时,F/F显著降低(P0.05),当辐射剂量达到16 0 0 Gy时,该值下降至最低,为0.13左右。由此可见,16 0 0 Gy的Co-射线辐射剂量削弱了坛紫菜自由丝状体的最大光化学量子产量,综合致死率的指标,判定
16、6 Co-射线的适宜诱变剂量为10 0 0 Gy。2.2UV单因子诱变2.2.1UV对致死率和突变率的影响如图4所示,随着UV照射时间的延长,ZD-1的致死率缓慢增加,突*0.5*0.40.30.2*0.100501254001 0001600辐射剂量Radiationdosage/Gy注:*和*分别表示辐射组与对照组在P0.05和P0.01水平差异显著。Note:*and*indicate significant difference between the irradiation groupand the control group at 0.05 and 0.01 level,respe
17、ctively.图360Co-射线诱变对坛紫菜ZD-1FJF的影响Fig.3Effect ofCo-raymutagenesis onFJF.ofN.haitanensis ZD-1变率持续上升后下降。在30 min时,ZD-1的致死率为18.7%,突变率为0.0 0 8%;在18 0 min时,致死率和突变率分别增加至51.7%、0.0 2 5%,突变率达到峰值,致死率接近50%;在36 0 min时,突变率下降至0.0 12%,致死率持续上升至7 0.0%。综合上述结果,初步判定紫外照射时间18 0 min是最有利于筛选出突变体的处理时间。2.2.2UV对F/F,的影响如图5所示,随着紫外
18、照射时间的延长,未辐射组ZD-1的F/F持续下降,与对照组相比,紫外照射30 min时,ZD-1的F/Fm显著降低151037卷报农学核0.05一致死率80突变率0.04600.03400.02200.010003060180360时间Time/min图4UV诱变对坛紫菜ZD-1致死率及突变率的影响Fig.4Effect of UVmutagenesis on the lethality andmutation rate of N.haitanensis ZD-1至0.37 7,照射时间延长至6 0 min时,ZD-1的F/F,极显著降低至0.2 8 8。照射时间达到36 0 min时,ZD-
19、1的F/F,降低至最小值0.2 18,由此可见,长时间的紫外照射减弱了ZD-1的光合作用。综合致死率指标,判定适宜的UV诱变时长为18 0 min。JoGy11 000Gy0.50.4*三工0.3*0.20.1003060180360时间Time/min注:*和*分别表示相同诱变条件下,诱变组与对照组之间在P0.05和P0.01水平差异显著。下同。Note:*and*indicate significant difference between mutation group andthe control group under same mutation method at 0.05 and
20、0.01 level,respectively.The same as following.图5UV及Co-射线-UV双因子诱变对坛紫菜ZD-1F/F.的影响Fig.5Effect of UV and Co-ray and UV two-factormutagenesis on FJF,of N.haitanensis ZD-12.3EMS单因子诱变2.3.1EMS对致死率和突变率的影响如图6 所示,在不同浓度EMS处理2 h的诱变条件下,ZD-1都出现了突变的藻丝,在最低浓度0.1molL-的处理下,ZD-1的致死率为4.9%,突变率为0.0 0 5%,随着浓度的增加,ZD-1的突变率先上升
21、后下降,致死率呈现逐渐上升的趋势,在0.4molL-诱变处理下,致死率达到峰值,为99.2%,接近全部死亡,因此该浓度不适合作为诱变条件。在0.2 molL-诱变处理下,致死率为46.8%,接近半致死率,突变率由0.1molL-条件下的0.0 0 5%增加至0.0 32%,初步判定采用0.2 molL-EMS进行诱变是筛选出突变体的有利条件。1200.040一致死率一突变率0.0351000.030800.025600.0200.015400.010200.0050000.10.20.4浓度 Concentration/(mol-L-)图6EMS诱变对坛紫菜ZD-1致死率及突变率的影响Fig.
22、6Effect of EMS mutagenesis on the lethality andmutation rate of N.haitanensis ZD-12.3.2EMS对F/F,的影响由图7 可知,随着EMS浓度的增加,未辐射组ZD-1的F/F,逐渐下降。当EMS的浓度为0.1molL-时,ZD-1的F/F降低至0.380,与对照组相比具有极显著差异,当EMS的浓度增加至0.2 molL-时,ZD-1的F/F仅为0.0 0 4。由此可见,0.2 和0.4molL-1的处理浓度对ZD-1造成了剧烈的损伤,此浓度不适宜作为诱变筛选的条件。综合致死率指标,最终判定使用EMS浓度为0.1m
23、olL-、处理时间为2 h是筛选出突变体的有利条件。0.5oGy1000Gy0.4*三0.3*0.20.1*000.10.2浓度 Concentration/(mol-L-)图7EMS及Co-射线-EMS双因子诱变对坛紫菜ZD-1F/F.的影响Fig.7Effect of EMS and Co-ray and EMS two-factormutagenesis on F,JF.of N.haitanensis ZD-12.46Co-射线-UV双因子诱变2.4.160Co-射线-UV双因子诱变对致死率和突变率的影响米将辐射剂量为10 0 0 Gy的ZD-1预培养2个月,作为双因子诱变的初始藻丝,
24、下一步进行UV1511坛紫菜丝状体不同诱变方法的比较研究8期照射,由图8-a可知,与单因子UV诱变相似,Co-射线-UV双因子诱变条件下的ZD-1突变率随紫外照射时间的延长先增加后减小,UV辐射18 0 min时,致死率为52%,接近半致死率,突变率比单因子UV在18 0 min处理下增加至0.0 8 2%,表明与单因子诱变相比,双因子诱变增加了突变的概率,初步判定UV辐射18 0 min为Co-射线-UV双因子诱变中UV的适宜诱变时长。2.4.2260Co-射线-UV双因子诱变对F/F,的影响6Co-射线和UV双因子诱变中,与单因子UV诱变相似,随着UV辐射时间的延长,ZD-1-1000Gy
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