米非司酮通过抑制糖皮质激素受体缓解应激后抑郁样行为的研究.pdf
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1、米非司酮通过抑制糖皮质激素受体缓解应激后抑郁样行为的研究韩雨清1,牛海晨2,李海英3,周阳1,包海军1*1徐州医科大学第一临床医学院法医学教研室,2生命科学院遗传学教研室,3基础医学院病理学教研室,江苏徐州221004摘要 目的:探讨米非司酮(mifepristone,RU486)与中缝背核区域内糖皮质激素(glucocorticoid,GC)受体在调控抑郁样行为症状中的作用,为抑郁症的治疗提供新的治疗靶点。方法:将8周龄健康雄性C57BL/6J小鼠32只分为对照组(n=8)、模型组(n=8)、溶媒组(n=8)和RU486组(n=8)。首先采用单一刺激禁锢法建立应激小鼠模型,采用高架十字迷宫实
2、验和悬尾实验检测小鼠行为学改变,然后选取中缝背核脑组织制备冰冻切片,采用免疫荧光染色法检测小胶质细胞和GC受体的激活情况。结果:高架十字迷宫实验结果表明,与对照组相比,模型组小鼠处于闭臂的时间占比明显增多,差异具有统计学意义(P0.05)。悬尾实验结果表明,与对照组相比,模型组小鼠静止时间明显增加,差异具有统计学意义(P0.05)。免疫荧光染色结果显示,应激后小鼠中缝背核区域内GC受体荧光占比增加(P0.05),同时应激后中缝背核区域内小胶质细胞荧光占比上升(P0.05),且激活荧光占比增多(P0.05)。腹腔注射RU486后,可见中缝背核区域内GC受体荧光占比减少(P0.05),小胶质细胞荧
3、光占比无明显改变(P0.05)、激活荧光占比降低(P0.05),抑郁样行为学表现减轻。结论:RU486通过激活中缝背核区域内小胶质细胞,缓解抑郁样行为,为治疗抑郁症提供了新的治疗靶点和治疗药物。关键词 应激状态;米非司酮;糖皮质激素受体;抑郁样行为中图分类号 R363文献标志码 A文章编号 10074368(2023)08110206doi:10.7655/NYDXBNS20230809Mifepristone relieving stress induced depressive like behaveior through inhibitingglucocorticoid receptor
4、sHAN Yuqing1,NIU Haicheng2,LI Haiying3,ZHOU Yang1,BAO Haijun1*1Department of Forensic,the First Clinical Medicine College,2Department of Genetics,Public Experimental ResearchCenter,3Department of Pathology,Basic Medicine College,Xuzhou Medical University,Xuzhou 221004,ChinaAbstract Objective:To inve
5、stigate the neural circuit of depressive symptoms derived from glucocorticoid(GC)receptor in dorsalraphe nucleus.Methods:Firstly,a stress mouse model was established using a single stimulus coufinement method,and the mice weredivided into four groups:control group,stresssd group,mifepristonetreated
6、group and vehicle group,then the mice were injected withGC receptor antagonists to test behavioral changes by tail suspension test and elevated plus maze test.Immunofluorescence was utilizedto detect the activation of GC receptors and microgial.Results:Compared with the control group,the immunofluor
7、escence resultshowed that the number of GC receptors in dorsal raphe nucleus was increased after stress stimulate.After intraperitoneal injectionof the GC receptor antagonists(mifepristone,RU486),the amount of GC receptors and the activated microglial cells were decreased inthe dorsal raphe nucleus
8、of the mice,and the depressionlike behaviors were also attenuated.Conclusion:The above results indicatedthat mifepristone regulates microglial cell activation in dorsal raphe nucleus to eventually reduce depressionlike behavior.Key words stressstate;mifepristone;glucocorticoid receptor;depressionlik
9、e behaviorJ Nanjing Med Univ,2023,43(08):11021107基金项目江苏省重点实验室开放课题(JBSL1703);徐州市科技计划(KC20120)通信作者(Correspondingauthor),Email:基础研究南京医科大学学报(自然科学版)Journal of Nanjing Medical University(Natural Sciences)第43卷第8期2023年8月1102随着生活节奏加快,抑郁症成为一种具有高自杀率、高致残率、高患病率特征的常见精神病,尤其是青少年学生,心理尤为脆弱,易感性增加。目前,药物治疗仍然是治疗抑郁症的首选方法。
10、然而,这些药物往往具有不良反应多、起效慢、停药易复发等缺点。研究新型的抗抑郁药物仍然是亟需解决的关键问题。应激是指机体在受到各种内外环境因素、社会因素和心理因素等刺激时出现的全身非特异性适应反应,又称应激反应,其包括多种生理和心理方面的改变并常常伴有焦虑、抑郁等症状1,研究显示约60%的抑郁症患者在发病前曾经历过应激事件,提示应激是抑郁的重要诱因2。小胶质细胞作为中枢神经系统内固有的免疫效应细胞,具有多突触及可塑性的特点。神经系统的紊乱通常导致炎症和小胶质细胞的激活,表现为小胶质细胞数量增加、表型发生改变并释放炎症介质导致氧化应激反应,介导阿尔兹海默症、帕金森病、抑郁样等多种慢性神经变性疾病的
11、生理过程3。应激可影响小胶质细胞释放细胞因子和神经营养因子,促进小胶质细胞介导的突触吞噬作用。有证据表明,在焦虑和抑郁相关疾病中,患者血浆皮质醇浓度明显升高或降低,这可能与下丘脑垂体肾上腺轴(the hypothalamicpituitaryadrenalaxis,HPA)的过度刺激有关4。也有人提出下丘脑促肾上腺皮质激素释放因子(corticotropinreleasingfactor,CRF)增加,导致垂体水平上CRF受体的适应性降低,进而引起肾上腺糖皮质激素(glucocorticoid,GC)受体敏感性增加,GC分泌增加5。在冠心病引起的全身慢性炎症疾病(如类风湿性关节炎)中,糖皮质激
12、素系统和炎症反应的变化被认为是一个完整的病理过程的一部分,其中GC和GC受体位于调节多种炎症途径的信号网络顶端,而GC信号和/或水平的改变,将导致不受抑制的炎症反应发生,从而促进病理发展。最新的研究发现,GC处理小鼠后中缝背核区域内色氨酸羟化酶(tryptophanhydroxylase,TPH)信使RNA水平降低,额叶皮质区域内血清素合成减少并出现抑郁样行为6,这种作用可被米非司酮(mifepristone,RU486)联合给药阻断,表明GC升高可能与精神疾病有关7。本研究推测,RU486将通过抑制中缝背核区域内GC受体结合,减少小胶质细胞激活并缓解抑郁样行为,进而起到治疗抑郁症的作用。因此
13、,本实验首先检测应激后中缝背核区域内GC受体和小胶质细胞激活情况,并通过行为学评估焦虑与抑郁程度,然后对应激后小鼠进行RU486药物处理,进一步观察其中缝背核区域内GC受体和小胶质细胞的激活情况,以及抑郁行为学的变化。1材料和方法1.1材料8周龄C57BL/6雄性小鼠,购自山东济南鹏悦实验动物繁育有限公司(生产许可证号:SCXK 鲁2019003)。实验过程中小鼠饲养于徐州医科大学动物实验中心,生长环境为 SPF 级,昼夜循环(12 h/12 h),恒温(2125),恒湿,所有实验均经过徐州医科大学实验动物伦理委员会审批通过(D2020017)。1.2方法1.2.1动物模型的建立选取健康的8周
14、龄雄性C57BL/6小鼠,随机分为对照组(n=8)、模型组(n=8)、溶媒组(n=8)和RU486组(n=8)。模型组、溶媒组和RU486组采取单一刺激禁锢法(每日禁锢2 h)8,连续7 d,构建应激模型,对照组不做处理。应激模型鼠造模完成后进行高架十字迷宫实验、悬尾实验检测小鼠应激及抑郁样行为表现9。1.2.2高架十字迷宫实验(elevated plus maze,EPM)EPM是评价啮齿类动物焦虑反应常用的实验方法,具有伤害性小、操作简单等优点。高架十字迷宫为黑色无味塑料材质,由两个开臂、两个闭臂和中间平台组成(臂长50 cm,宽10 cm,高于地面70 cm)。测试开始前30 min将小
15、鼠放置于实验室内,使其熟悉实验室环境,并在实验前让小鼠在迷宫中自由探索5 min。实验开始时,将小鼠放置于中间平台并记录5 min内小鼠位于高架上的位置及时间,重复测量3 d,使用ANYmaze软件记录。评价指标:闭臂时间占比=进入闭臂时间/(开臂时间+闭臂时间)10。1.2.3悬尾实验(tail suspension test,TST)TST是一种经典而又能快速评价抑郁程度及抗抑郁药疗效的方法,其原理是小鼠悬尾后企图逃脱但又无法逃脱,从而放弃挣扎,进入特有的抑郁不动状态,实验过程中记录动物不动时间来反映抑郁状态,抗抑郁药物、兴奋药物能明显地改变其状态。实验前 30 min 将小鼠放入实验室熟
16、悉环境。实验时,将小鼠尾部后1/3固定于悬挂支架上,头部离地面约20 cm,进行摄像,摄像背景与小鼠颜色呈明显反差。使用ANYmaze软件记录小鼠5 min内静第43卷第8期2023年8月韩雨清,牛海晨,李海英,等.米非司酮通过抑制糖皮质激素受体缓解应激后抑郁样行为的研究 J.南京医科大学学报(自然科学版),2023,43(8):1102-11071103南京医科大学学报第43卷第8期2023年8月止与活动的时间(s)。评价指标:活动时间/(活动时间+静止时间)9。1.2.4灌注取材对小鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠溶液(0.008 mg/g)进行麻醉后,将小鼠沿腹中线剪开,暴露胸腔心脏。将灌注用针
17、头自左心室下角插入后,剪开右心耳,通过针头先注入20 mL 0.9%NaCl,可见小鼠肝脏颜色变化。待右心耳流出清澈液体后,注入20 mL4%多聚甲醛(paraformaldehyde,PFA)。灌注完毕后,用剪刀分离小鼠头部,从后向前剥离颅骨取出鼠脑。将取出的鼠脑放入 4%PFA 中固定。24 h后,换成 20%蔗糖溶液继续固定。待鼠脑沉底后,更换为 25%蔗糖溶液继续固定。鼠脑再次沉底后,更换为 30%蔗糖溶液固定。待鼠脑于 30%蔗糖溶液中沉底,表明沉糖完毕,鼠脑中水分已经充分排出。1.2.5免疫荧光(immunofluorescence,IF)染色将冰冻玻片从冰箱取出,放入37 温箱内
18、复温30 min 后,取出于 PBS 清洗(0.01 mol/L,3 min3次),滤纸吸干多余水分后用组化笔圈画组织。将0.3%Triton X100溶液和10%驴血清加入PBS中稀释后滴加于玻片上,室温封闭1 h。封闭完成后用PBS清洗(0.01 mol/L,3 min3次),滤纸吸干多余水分后滴加一抗,包括小鼠抗GC 受体抗体(1400,上海 Absin 公司)、兔抗 IBA1 抗体(1100,NovusBiologicals 公司,美国)和大鼠抗 CD11b 抗体(1 100;Thermo Fisher Scientific公司,美国)加PBS稀释后滴加与玻片上,4 过夜。一抗孵育完成
19、后取出,用PBS清洗(0.01 mol/L,3 min3次)后滴加二抗室温孵育2 h,清洗后DAPI复染10 min,PBS清洗后封片镜下观察,观察使用研究级倒置荧光显微镜(BX53/DP73,Olympus公司,日本)。1.2.6药物处理将 应 激 后 小 鼠 随 机 分 为 RU486 组 和 溶 媒组,RU486 组腹腔注射糖皮质激素受体抑制剂(1 mg/100 g,每天4次,Mifepristone84371653,上海Absin公司),将RU486按适当浓度溶解于无水乙醇溶液中,充分溶解后加入无菌生理盐水稀释,稀释完成后通过腹腔注射给药。溶媒组腹腔注射乙醇盐溶液(1 mg/100 g
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