基于UHPLC-Q-TOF MS结合分子网络技术快速分析荷叶中生物碱类成分.pdf
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1、该研究采用超高效液相色谱四极杆飞行时间串联质谱(UHPLCQTOF MS)和分子网络整合技术,快速分析和鉴定了荷叶中的生物碱类化学成分。采用Acquity UPLC HSS T3色谱柱(100 mm 2.1 mm,1.8 m),以0.1%甲酸水和0.1%甲酸乙腈溶液为流动相进行梯度洗脱,流速为0.3 mL/min,在正离子模式下采集质谱数据信息。将经格式转换后的荷叶提取物二级质谱数据上传至全球天然产物社会分子网络(GNPS)平台计算分析,借助Cytoscape 3.6.1软件构建可视化分子网络,获得了单苄基异喹啉类、双苄基异喹啉类和阿朴啡类生物碱类型的粒子簇。根据对照品、色谱保留时间、特征碎片
2、离子、MS/MS裂解规律和文献报道等信息,从荷叶中共鉴定和推测57种生物碱类成分,包括27个单苄基异喹啉类、2个双苄基异喹啉类、25个阿朴啡类和3个其他类生物碱,其中19个成分为潜在新化合物,30个成分在荷叶中首次报道。该方法快速、准确,可为荷叶的药效物质基础研究提供参考,为中药化学成分的快速定性分析提供借鉴。关键词:荷叶;UHPLCQTOF MS;分子网络;生物碱中图分类号:O657.63;R284.1 文献标识码:A 文章编号:1004-4957(2023)08-0893-14Rapid Identification of Alkaloid Components in Nelumbinis
3、 Folium Based on UHPLCQTOF MS Combined with Molecular Network TechnologyGUO Zhong-hui1,3,4,QIN Chun-ping1,LIANG Jie1,3,LI Yao-hua3,CHEN Kui-kui1,3,4*,XIAO Hong-bin2,4*(1College of Pharmacy,Guangxi University of Chinese Medicine,Nanning 530200,China;2Beijing Research Institute of Chinese Medicine,Bei
4、jing University of Chinese Medicine,Beijing 100029,China;3Key Laboratory of TCM Extraction and Purification and Quality Analysis,Education Department of Guangxi Zhuang Autonomous Region,Nanning 530200,China;4Research Center for Chinese Medical Analysis and Transformation,Beijing University of Chines
5、e Medicine,Beijing 100029,China)Abstract:A rapid analytical method of ultrahigh performance liquid chromatographyquadrupoletime-of-flight tandem mass spectrometry(UHPLCQTOF MS)and molecular network integration was established for the identification of alkaloids in Nelumbinis Folium in this paperThe
6、Acquity UPLC HSS T3 column(100 mm 2.1 mm,1.8 m)was selected for gradient elution,with water-0.1%formic acid and acetonitrile-0.1%formic acid as the mobile phases at a flow rate of 0.3 mL/min,and mass spectrometry data informations were collected in positive ion modeMS/MS data of Nelumbinis Folium ex
7、tract after format conversion were uploaded to the Global Natural Products Social Molecular Network(GNPS)platform for calculation and analysis,and a visual molecular network doi:10.19969/j.fxcsxb.23040607收稿日期:20230406;修回日期:20230511基金项目:科学技术部重大新药创制国家科技重大专项课题(2019ZX09201004);国家自然科学基金项目(82160771);广西科技基
8、地与人才专项(桂科AD21238032);广西青年科学基金项目(2023GXNSFBA026276);广西中医药大学博士科研启动项目(2020BS015);广西中医药大学青年科学基金(2021QN006)通讯作者:陈奎奎,博士,讲师,研究方向:中药分析及体内过程研究,E-mail:肖红斌,博士,教授,研究方向:药物分析、中药新药研发,E-mail:研究报告第 42 卷分析测试学报was built with the help of Cytoscape 3.6.1 software,and three particle clusters of monobenzyl isoquinolines,a
9、porphines and dibenzyl isoquinolines were obtainedAccording to the similarity of reference substances,chromatographic retention time,characteristic fragment ions,MS/MS cracking rules,literatures and other information,a total of 57 compounds were identified and speculated in Nelumbinis Folium,includi
10、ng 27 monobenzylisoquinolines,2 bisbenzylisoquinolines,25 aporphines and 3 other classes,of which 19 potential new compounds were reported in Nelumbinis Folium,and 30 compounds were found in Nelumbinis Folium for the first timeThe method is rapid and accurate,and it could provide a reference for the
11、 basic research on medicinal substances of Nelumbinis Folium,as well as the rapid qualitative analysis of chemical components in traditional Chinese medicines.Key words:Nelumbins Folium;UHPLCQTOF MS;molecular networking;alkaloids荷叶为睡莲科(Nymphaeaceae)植物莲Nelumbo nucifera Gaertn.的干燥叶,具有清暑化湿、升发清阳、凉血止血的功效
12、1。荷叶是药食两用的中药,常用于药品和辅助调血脂保健品中,此外,闽南地区人民有用荷叶泡茶、煲汤的习惯。现代研究表明生物碱类为荷叶主要的特征活性成分群,具有调脂减肥、抗动脉粥样硬化、抗氧化、抗病毒、抗衰老、抑菌等作用26,研究与开发前景广阔。荷叶生物碱的研究可追溯到1961年,Fukuda等7首次从荷叶中分离出荷叶碱、莲碱和O-去甲荷叶碱3种生物碱。至今,国内外学者已从荷叶中分离出27个生物碱8,主要包括单苄基异喹啉类、双苄基异喹啉类和阿朴啡类。目前,荷叶中生物碱类成分的研究多集中在传统分离制备、含量测定或少数高含量成分定性分析方面,尚未见对荷叶中生物碱的系统性鉴定研究。超高效液相色谱四极杆飞行
13、时间串联质谱(UHPLCQTOF MS)技术具分离效率高、扫描速度快、分辨率高、灵敏度高等特点910,常被应用于中药等复杂体系的鉴别分析。然而,由于中药化学成分复杂,质谱数据的解析往往费时耗力且具有一定挑战。全球天然产物社会分子网络(GNPS)是基于化合物质谱碎片模式的相似性创建的分子网络数据库,分子网络(Molecular networking)是其主要的分析工具,根据MS/MS质谱碎片的相似性,可将结构类似的化合物在一个分子网络中聚集成簇并进行可视化定性分析1113。近年来,基于高效液相色谱高分辨质谱联用技术的分子网络已逐渐应用于中药化学成分分析,如黄飞飞等14 基于HPLCQTOFMS/
14、MS结合分子网络技术快速分析了夏天无中的57种生物碱类成分;陈士林等15 基于分子网络技术快速、准确地鉴定出紫菀中的43个肽类化合物。分子网络结合UHPLCQTOF MS技术有助于提高复杂质谱数据的解析效率,可为中药复杂成分的深度分析提供科学依据。本研究采用UHPLCQTOF MS和分子网络整合技术,建立了荷叶中生物碱类成分的分子网络,根据可视化离子间的聚集与分布,进行快速系统的分析和表征,并总结了其质谱裂解规律。1 实验部分 1.1材料、试剂与仪器荷叶(批号70511101)购于北京三和药业有限公司,由北京中医药大学中药学院王学勇教授鉴定为睡莲科(Nymphaeaceae)植物莲 Nelum
15、bo nucifera Gaertn.的干燥叶。对照品荷叶碱(批号 111566201706)、乌药碱(批号W011161212)、亚美罂粟碱(批号HYN6857)、N-去甲荷叶碱(批号D008180917)、O-去甲荷叶碱(批号DFZY191227)、甲基莲心碱(批号J033171216)均购于成都瑞芬思生物科技有限公司,纯度均大于98%。乙腈、甲酸、甲醇均购于美国Fisher公司,均为质谱纯。Agilent 1290超高效液相色谱Agilent 6550离子漏斗四极杆飞行时间串联质谱仪:配有电喷雾双喷离子源(Dual AJS ESI)及Agilent MassHunter Qualitat
16、ive Analysis B.07.00数据处理系统(美国安捷伦科技有限公司);MilliQ超纯水制备仪(美国Millipore公司);KQ500E型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);H1650W型台式微量高速离心机(湖南湘仪离心机仪器有限公司);MXF型涡旋仪(大龙兴创实验仪器(北京)股份公司);NewClassic MF型电子分析天平(瑞士梅特勒公司)。1.2溶液配制取荷叶适量,加10倍量水,加热回流提取3次,每次1 h,过滤、合并滤液、浓缩、醇沉(醇沉浓度60%),减压干燥,粉碎得荷叶提取物粉末。取提取物粉末约100 mg,加入10 mL的80%甲醇,超声提取30 min,静置放冷
17、,过滤,取上清液,以12 000 r/min离心15 min后,取上清液即得供试品溶液。894第 8 期郭忠会等:基于UHPLCQTOF MS结合分子网络技术快速分析荷叶中生物碱类成分精密称取各对照品(荷叶碱、N-去甲荷叶碱等)粉末适量,用少量二甲基亚砜助溶,以80%甲醇为溶剂,配制单个对照品储备液及混合对照品溶液,4 避光保存,备用,得对照品溶液。1.3实验方法及数据处理1.3.1色谱条件色谱柱:Acquity UPLC HSS T3柱(100 mm 2.1 mm,1.8 m,Waters公司);流动相:0.1%甲酸水(A)0.1%甲酸乙腈(B);梯度洗脱:0 3 min,5%10%B;3
18、15 min,10%35%B;15 20 min,35%95%B;20 22 min,95%100%B;22 25 min,100%B;流速:0.3 mL/min;检测波长:254、286 nm;柱温:45;进样体积:2 L。1.3.2质谱条件扫描模式:正离子电离模式;干燥气温度:200,干燥气流速:14 L/min;喷雾气压力:241 316 Pa;鞘气温度:350,鞘气流速:11 L/min;喷嘴电压:1 000 V;毛细管出口电压:380 V;毛细管电压:4 000 V(ESI);碰撞能量:10、20、40 V;质谱扫描范围:m/z 100 1 100。参比:Purine和HP0921,
19、正离子模式下,m/z分别为121.050 9和922.009 8。1.3.3GNPS分子网络建立方法GNPS网站平台支持mzXML、mzML和mgf格式的数据文件15。建立步骤如下:(1)采用MS convert软件将荷叶提取物样品的原始二级质谱数据转换为mzXML数据文件格式;(2)将转换格式后的数据文件通过Win SCP客户端上传至GNPS平台并建立分子网络,设置网络参数为高分辨率,余弦分数阈值为0.7,最小匹配碎片离子为6,topK值为10,母离子之间的最大质量偏差为500 u,其余参数为默认值;(3)运用Cytoscape 3.6.1软件将所得的分子网络结果可视化。2 结果与讨论 采用
20、UHPLCQTOF MS联合分子网络技术从荷叶中共鉴定和推测出57种生物碱类成分,包括27个单苄基异喹啉类生物碱,2个双苄基异喹啉类生物碱,25个阿朴啡类生物碱,3个其他类生物碱,其中19个成分为潜在新化合物,30个成分在荷叶中首次报道。生物碱类化合物的具体信息见表1。表1荷叶中生物碱类成分的鉴定Table 1Identification of alkaloids constituents in Nelumbinis Folium12345678910111.362.432.933.183.994.424.484.644.684.774.89C10H13N5O4C11H13NO2C22H27N
21、O8C22H27NO8C12H15NO2C23H29NO8C16H17NO3C17H19NO3C24H31NO8C16H15NO3C22H27NO8268.104 0192.101 9434.180 9434.180 9206.117 6448.196 6272.128 1286.143 8462.212 2270.112 5434.180 9268.104 7192.102 9434.180 0434.179 9206.118 2448.195 9272.128 9286.143 9462.211 8270.113 4434.180 5-2.47-5.682.442.76-3.251.81-
22、2.47-0.131.16-3.661.36136.062 5,119.034 9177.078 9,162.053 4,148.077 0272.116 1,255.101 3,237.088 1,161.060 0,143.049 1,107.049 3272.126 4,255.102 6,237.087 4,161.060 1,143.049 0,123.044 7,107.049 5191.093 9,190.086 1,175.063 8,160.074 4,145.087 8286.143 3,269.116 5,237.092 1,209.097 3,175.075 3,107
23、.050 2255.103 2,237.092 6,209.097 0,161.060 9,107.050 5255.101 3,243.101 5,237.088 9,225.090 1,161.060 4,107.049 2300.158 8,269.116 8,237.090 6,175.075 9,107.048 1255.102 3,237.092 3,161.060 0,107.049 9255.100 8,237.086 9,161.059 9,143.050 1,123.044 6,107.050 0Adenosine(腺苷)Dehydroheliamine(6,7-二甲氧基-
24、3,4-二氢异喹啉)Norcoclaurine-4-O-glucoside(去甲乌药碱-4-O-葡萄糖苷)Norcoclaurine-6-O-glucoside(去甲乌药碱-6-O-葡萄糖苷)Dehydrosalsolidine(6,7-二甲氧基-1-甲基-3,4-二氢异喹啉)Coclaurine-O-glucoside*(乌药碱-O-葡萄糖苷)Norcoclaurineb(去甲乌药碱)N-Methylnorcoclaurine(N-甲基去甲乌药碱)N-Methylcoclaurine-O-glucoside*(N-甲基乌药碱-O-葡萄糖苷)1,2-Dehydronorcoclaurine*(
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