家族性噬血细胞综合征临床特征及基因突变分析.pdf
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1、目的对 4 例家族性噬血细胞综合征患儿进行临床表型分析和基因变异检测,明确其分子病因。方法选取 2018 至 2021 年到昆明市儿童医院检验科采血的患儿进行病史采集,体格检查,血常规,血生化,腹部彩超,骨髓细胞学形态等检查确诊为家族性噬血细胞综合征的 4 例患儿,获取外周血 DNA 对患儿进行高通量测序,并针对变异位点对家系成员进行 Sanger 测序验证。结果4例患儿均因高热就诊,完善临床检查,患儿血相异常,血细胞减少(2 系以上细胞受累),肝/脾大,纤维蛋白原下降,血清铁蛋白、血清甘油三酯升高,骨髓发现噬血细胞现象,未见恶性肿瘤细胞。对4 例患儿进行基因检测,其中,3 例患儿 PRF1(
2、NM_001083116.2)基因 c.1349CT(p.T450M)纯合突变,1 例患儿 UNC13D(NM_199242.2)基因 c.3134CT/c.7548CT(p.T1045M/p)复合杂合突变。两个基因的错义突变位点在多个同源物种间高度保守,本次检测出一个新的内含子变异。综合临床表现及基因检测结果,3 例患儿诊断为家族性噬血性淋巴组织细胞增生症 2 型(OMIM:603553),1 例患儿诊断为家族性噬血细胞综合征 3 型(OMIM:608898)。结论PRF1、UNC13D 基因突变可能是 4 例患儿的致病原因。关键词 家族性噬血细胞综合征;PRF1 基因;UNC13D 基因;
3、基因突变Clinical features and gene mutation analysis of familial hemophagocytic lymphohistiocytosisZHOU Bailing,HUANG Tilong,ZHUANG Yu,SHI Shulan,ZHAO Guangzhou,XIA Shimei,KUI Liyue(Department of Clinical Laboratory,Kunming Childrens Hospital,Kunming,Yunnan,China,650228)ABSTRACT ObjectiveTo analyze the
4、clinical phenotype and screen the genetic mutations in fourchildren with familial hemophagocytic lymphohistiocytosis to clarify their molecular biology etiology.MethodsFrom 2018 to 2021,4 children who were diagnosed with familial hemophagocytic syndrome by medicalhistory collection,physical examinat
5、ion,blood routine,blood biochemistry,abdominal color Doppler ultrasound,bone marrow cytology.DNA was extracted from patients peripheral blood for highthroughput sequencing,and Sanger sequencing was performed on family members for mutation sites.ResultsAll four patients presented with fever.A complet
6、e clinical examination was performed,and the results showed that thechildren had abnormal blood items,cytopenia(involvement of more than two lineage cells),liver/spleen enlargement,decreased fibrinogen,and increased serum ferritin and serum triglycerides.Hemophagocytosis canbe observed in bone marro
7、w,and malignant cells were not found.Gene sequencing was performed in 4 children.Among which three patients had a homozygous mutation in the PRF1(NM_001083116.2)gene c.1349CT(p.T450M),and one patient had a homozygous mutation in the UNC13D(NM_199242.2)gene c.3134CT/c.7548CT(p.T1045M/p)compound heter
8、ozygous mutation.The missense mutation sites of the two genes arehighly conserved across multiple homologous species,and a novel intronic variant was detected.Combinedwith clinical manifestations and genetic testing results,three children were diagnosed with familial hemophago 1173分子诊断与治疗杂志2023年7月第1
9、5卷第7期J Mol Diagn Ther,July 2023,Vol.15No.7cytic lymphohistiocytosis type 2(OMIM:603553),and one child was diagnosed with familial hemophagocytic syndrome type 3(OMIM:608898).ConclusionPRF1 and UNC13D gene variants may be the pathogeniccauses of 4 cases.KEY WORDSFamilial hemophagocytic lymphohistiocy
10、tosis;PRF1 gene;UNC13D gene;Geneticmutation噬血细胞综合征,又称噬血细胞性淋巴组织细 胞增多症(Hemophagocytic lymphohistiocytosis,HLH),是一种以T淋巴细胞和巨噬细胞过度激活和过度增殖为特征的免疫缺陷病1。HLH分为原发性和继发性两种类型,原发性 HLH 包括家族性 HLH(Familial hemophagocytic lymphohistiocytosis,FHL)和遗传性免疫缺陷相关 HLH。原发性 HLH 为常染色体隐性遗传,通常发生于儿童,继发性 HLH 常与感染、恶性肿瘤、风湿免疫性疾病相关24。HLH
11、 导致患者骨髓、肝、脾、脑等器官的浸润和损伤。家族性 HLH 通常表现为一种急性疾病,伴有长期高烧,细胞减少,肝脾肿大,凝血功能障碍,血细胞减少,高 铁 蛋 白 血 症 和 NK 细 胞 溶 解 活 性 减 弱 或 缺失1,5。HLH 由与细胞毒性 T 淋巴细胞和自然杀伤(Natural killer,NK)细胞内分泌性溶酶体的形成和功能相关基因的突变引起。FHL 包括 5 个亚型(FHL1 FHL5),已 知 4 个 致 病 基 因:PRF1(FHL2)、UNC13D(FHL3)、STX11(FHL4)、STXBP2(FHL5)67,FHL1 的致病基因尚未清楚。本研究探讨 4 例 HLH
12、患儿的临床特点,并对患儿进行基因测序,结合生物信息学分析,明确了 PRF1、UNC13D 基因突变是患儿的分子生物学致病原因。1材料和方法1.1患儿一般情况选取 2018 至 2021 年到昆明市儿童医院检验科采血的 4 例患儿,来自云南地区,年龄 210 岁,2 男 2 女,均因“发热”入院就诊,体温 37.840.0,其中有两例患儿出现腹痛或腹泻症状。收集患儿和家系成员的临床资料,系统进行全面体格检查。本研究经院医学伦理委员会批准同意,基因诊断取得患儿家属的同意并签署知情同意书(患儿由监护人代签)。1.2实验室检查1.2.1常规检查进行血常规,血生化,凝血功能,免疫学,腹部彩超等常规实验室
13、检查。1.2.2骨髓细胞学检查通过骨髓穿刺术抽取患儿骨髓组织,涂片、干燥,进行瑞氏染色/吉姆萨染色,镜检。1.3基因分析经患儿家属同意,留取患儿及其父母静脉血3 mL,采用高通量测序技术分析免疫疾病相关基 因,根 据 ACMG(American College of MedicalGenetics and Genomics)指南判定变异位点的致病性。通过 Sanger 测序方法验证患儿所发现的突变及父母源性检测。2结果2.1临床检测结果4 例患儿均存在发热,肝/脾大,血细胞减少(2 系以上细胞受累),铁蛋白升高,高甘油三酯血症,低纤维蛋白原血症,凝血功能障碍,骨髓出现噬血现象,1 例患儿 NK
14、 细胞活性下降。见表 1、图 1。2.2基因检测结果患儿 1、2、3 分别检出 PRF1 基因 c.1349CT(p.T450M)纯合突变,为错义突变,导致编码的第450 位苏氨酸被甲硫氨酸代替。Sanger 测序进行家系验证,3 例患儿的父母均为 PRF1 c.1349CT杂合携带者,以上突变分别遗传自他们的父母。患儿 4 UNC13D 基因 31 号外显子存在 c.3134CT(p.T1045M)杂合突变,且 UNC13D 基因 9 号内含子区域存在 c.7548CT 杂合突变,Sanger 测序证实 c.3134CT 杂合突变来自于其母亲,c.7548CT杂合突变来自于其父亲,2 个变异
15、为复合杂合突变,符合常染色体隐性遗传。见图 2。其中,c.7548CT 位点未被 HGMD 数据库收录,属于新发变异。见表 2。3讨论HLH 临床表现复杂且缺乏特异性,临床早期诊断难度较大。根据 2022 年国际组织细胞协会修订标准诊断本研究 4 例患儿10。1174分子诊断与治疗杂志2023年7月第15卷第7期J Mol Diagn Ther,July 2023,Vol.15No.7主要指标一般情况血常规血生化凝血功能免疫学其它性别年龄发病症状白细胞中性粒细胞绝对值红细胞血红蛋白血小板丙氨酸转氨酶天冬氨酸转氨酶甘油三酯胆固醇凝血酶原时间APTT纤维蛋白原血清铁蛋白T 细胞亚群NK 细胞腹部彩
16、超骨髓检查患儿 1男10 岁发热1.07 0.44 3.88 102.00 24.00 300.00 366.00 6.59 2.23 13.10 41.90 1.50 3 100.00 CD4+:47.22CD8+:20.412.37肝稍大,脾脏中度肿大可见噬血细胞患儿 2女9 岁 3 月发热,腹痛3.75 0.70 2.77 73.00 65.00 18.0035.002.81 1.69 14.30 37.80 2.07 653.30 CD4+:47.43CD8+:23.525.73脾大可见噬血细胞患儿 3女10 岁 11 月发热2.15 0.67 3.57 91.00 40.00 27.
17、0051.00 4.82 2.05 13.30 41.50 1.37 901.20 CD4+:58.80CD8+:19.606.73脾脏中度肿大可见噬血细胞患儿 4男2 岁 4 月发热,腹泻3.75 0.934.24 116.00247.00254.00 79.00 135.00 4.9613.0042.70 1.89 1030.00 CD4+:31.50CD8+:17.5227.93肝稍大可见噬血细胞参考值512109/L0.885.7109/L4.41109/L110148 g/L100450109/L040 U/L40 U/LT Wt/c.1349CTc.1349CT/c.1349CT1
18、12家系 2 PRF1 基因Wt/c.1349CT Wt/c.1349CTc.1349CT/c.1349CT1112家系 3 PRF1 基因Wt/c.1349CT Wt/c.1349CTc.1349CT/c.1349CT112家系 3 PRF1 基因Wt/c.1349CT Wt/c.1349CTc.1349CT/c.1349CT112家系 4 UNC13D 基因Wt/c.3134CTWt/c.7548CTc.7548CT/c.3134CT112注:方框代表男性,圆圈代表女性;黑色代表患者,灰色代表携带者。图 24 例患儿家系图Figure 2Family pedigree of four pa
19、tientsA AB BC CD D注:100,油镜瑞吉染色结果。骨髓中可见明显的吞噬现象(红色箭头),未发现恶性肿瘤的迹象;A、B、C 和 D 分别代表患儿 1、2、3 和 4。图 14 例 HLH 患儿的骨髓检查结果Figure 1Bone marrow examination results of four patients with HLH患者患儿 1患儿 2患儿 3患儿 4患儿 4基因PRF1PRF1PRF1UNC13DUNC13D外显子/内含子Extron3Extron3Extron3Extron31Intron9cDNAc.1349CTc.1349CTc.1349CTc.3134
20、CTc.7548CT氨基酸p.T450Mp.T450Mp.T450Mp.T1045Mp.?纯合/杂合纯合纯合纯合杂合杂合ACMGPathogenicPathogenicPathogenicVUSVUS来源父母杂合携带父母杂合携带父母杂合携带母亲杂合携带父亲杂合携带文献8889Novel表 24 例 HLH 患儿的基因检测结果Table 2Gene sequence of four patients with HLH注:VUS,variants of uncertain significance,临床意义未明的变异。1175分子诊断与治疗杂志2023年7月第15卷第7期J Mol Diagn T
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