基于UHPLC-QTRAP-MS_MS的淫羊藿中多元活性成分动态累积的分析与评价.pdf
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1、第42 卷 第 8 期2023 年8 月Vol.42 No.8907919分析测试学报FENXI CESHI XUEBAO(Journal of Instrumental Analysis)基于UHPLCQTRAPMS/MS的淫羊藿中多元活性成分动态累积的分析与评价薛佳1,陈海杰1,周永逸1,石婧婧1,邹立思1,袁嘉欢1,蔡芷辰1,吴楠1,陈翠花1,刘训红1,2*,杨薇1,程建明1,2(1南京中医药大学 药学院,江苏 南京 210023;2江苏省经典名方工程研究中心,江苏 南京 210023)摘要:建立了超高效液相色谱三重四极杆线性离子阱串联质谱(UHPLCQTRAPMS/MS)同时测定淫羊藿
2、中黄酮类、生物碱类、酚酸类、氨基酸类及核苷类共50种活性成分的分析方法,并对其多元活性成分的动态累积进行分析与评价。采用 Agilent ZORBAX ExtendC18(2.1 mm 100 mm,1.8 m)色谱柱,以水(含0.2%甲酸)乙腈为流动相梯度分离,流速0.3 mL/min,柱温40。质谱配备电喷雾离子源,在正、负离子模式下采用多反应监测模式(MRM)进行测定;采用单因素实验及响应面法优化样品制备条件,灰色关联度分析(GRA)对不同采收期淫羊藿样品进行分析与评价。结果显示,50种目标成分在一定范围内线性关系良好(r2 0.999 0),精密度、重复性和稳定性良好,平均加标回收率为
3、94.5%107%,相对标准偏差(RSD)均小于5.0%。淫羊藿中多元活性成分累积量在7月中旬出现峰值,不同类别成分累积规律具有一定差异性。6月下旬至7月下旬所采收的淫羊藿药材综合质量较好,与当地传统采收期基本吻合。该研究所构建的方法准确、可靠,可为探究淫羊藿中多元活性成分动态累积规律及确定适宜采收期提供依据,同时也箭叶淫羊藿药材质量的综合评价和整体控制提供方法参考。关键词:淫羊藿;多元活性成分;动态累积;超高效液相色谱三重四极杆线性离子阱串联质谱(UHPLCQTRAPMS/MS);灰色关联度分析(GRA)中图分类号:O657.63;TQ460.72 文献标识码:A 文章编号:1004-495
4、7(2023)08-0907-13Analysis and Evaluation on Dynamic Accumulation of Multiple Bioactive Constituents in Epimedii Folium Based on UHPLCQTRAPMS/MSXUE Jia1,CHEN Hai-jie1,ZHOU Yong-yi1,SHI Jing-jing1,ZOU Li-si1,YUAN Jia-huan1,CAI Zhi-chen1,WU Nan1,CHEN Cui-hua1,LIU Xun-hong1,2*,YANG Wei1,CHENG Jian-min1,
5、2(1School of Pharmacy,Nanjing University of Chinese Medicine,Nanjing 210023,China;2Jiangsu Province Engineering Research Center of Classical Prescription,Nanjing 210023,China)Abstract:An ultra high performance liquid chromatographytriple quadrupole linear ion-trap mass spectrometry(UHPLCQTRAPMS/MS)w
6、as developed for the simultaneous determination of 50 active constituents including flavonoids,alkaloids,phenolic acids,amino acids,and nucleosides in Epimedii Folium harvested at different periods,and the dynamic accumulation of multiple active conctituents was analyzed and eveluatedThe samples wer
7、e separated on an Agilent ZORBAX ExtendC18 column(2.1 mm 100 mm,1.8 m)by gradient elution,with 0.2%formic acid aqueous solutionacetonitrile as mobile phase at 40 and a flow rate of 0.3 mL/min,then determined by MS with electrospray ion source in positive and negative modes under the multiple reactio
8、n monitoring(MRM)modeMeanwhile,single factor experiment and response surface methodology were used to optimize the extraction conditionsGrey correlation analysis(GRA)was used to analyze and evaluate the samples harvested at different periodsThe results showed that there were good correlations betwee
9、n the mass concentrations of 50 constituents and the corresponding peak areas,with correlation coefficients(r2)not less than 0.999 0.The method showed good precision,repeatability and stadoi:10.19969/j.fxcsxb.23040101收稿日期:20230401;修回日期:20230506基金项目:江苏高校品牌专业建设工程资助项目(PPZY2015A070)通讯作者:刘训红,教授,博士生导师,研究方
10、向:中药鉴定与品质评价,E-mail:第 42 卷分析测试学报bility for all the target constituentsThe average recoveries ranged from 94.5%to 107%,with RSDs less than 5.0%The accumulation of multiple active constituents in Epimedii Folium reached its peak level in mid-July,and there were certain differences in the accumulation p
11、atterns for each category of constituents.The results of GRA showed that the top three quality samples are S9,S8,and S10,and the maximum ri difference value was 31.63%,indicating that the GRA model could distinguish the quality of Epimedii Folium in different harvesting periodsSamples collected from
12、 late June to late July had better quality,which were consistent with the traditional harvest period.With accuracy and reliability,the method established in this paper provides an experimental basis for exploring the dynamic accumulation patterns of multiple active constituents and further clarifyin
13、g the appropriate harvest period of Epimedii Folium,and it also offers a new method reference for the comprehensive evaluation and overall control on the quality of Epimedii Folium.Key words:Epimedii Folium;multiple bioactive constituents;dynamic accumulation;ultra high performance liquid chromatogr
14、aphytriple quadrupole linear ion-trap mass spectrometry(UHPLCQTRAPMS/MS);grey correlation analysis(GRA)淫羊藿(Epimedii Folium)又名“三枝九叶草”,始载于 神农本草经1,是临床常用药材,药用部位为叶,其味辛、甘、温,归肝、肾经,具有补肾阳、强筋骨、祛风湿之传统功效2。箭叶淫羊藿(Epimedium sagittatum(Sieb.et Zucc.)Maxim)为淫羊藿药材的主要植物来源之一3。多项研究表明,淫羊藿药材中的活性成分种类丰富,包括黄酮4、多糖5、木脂素、生物碱6、有
15、机酸7、挥发油、氨基酸及核苷8等。其中黄酮类成分含量最为丰富,以淫羊藿多苷(淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B和朝藿定C)为代表的黄酮醇苷类成分在应对骨和骨关节、内分泌组织、心血管系统、免疫组织及肿瘤等疾病时均具有良好的功效910;多糖类成分有抗病毒、抗肿瘤11、延缓衰老12、调节免疫等药理作用5,13;生物碱可通过提高睾丸和附睾系数达到保护生殖系统作用14;同时,淫羊藿在治疗哮喘、低血糖、炎症等疾病时也有显著效果1516。中药材质量的优劣与采收环节密切相关,适时采收是中药产业实现质量标准的重要前提17,对确保药材临床疗效有着十分重要的意义。中药材化学成分组成复杂,且随着生长过程呈现动态变化18。2
16、020版 中国药典 仅规定淫羊藿药材夏、秋季茎叶茂盛时采收2,但时间跨度较大,并未对采收期提供更加确切有效的指导19。目前对于淫羊藿适宜采收期相关研究报道尚少,考察其适宜采收期的成分指标仅限于药材中一种或几种黄酮醇苷类成分2022。因此,为保证淫羊藿药材质量的均衡和优良,有必要进一步探究淫羊藿中多元活性成分的动态累积规律,从而为确定淫羊藿药材适宜采收期提供理论依据。淫羊藿药材目前在质量评价中多选取单一或单黄酮类成分进行考察,分析方法有高效液相色谱法(HPLC)2226、快速分辨液相色谱法(RRLC)27和超高效液相色谱法(UPLC)28等。传统HPLC方法耗时较长,对极性相似的化合物分离效果较
17、差2931。超高效液相色谱三重四极杆线性离子阱质谱(UHPLCQTRAPMS/MS)有效地解决了HPLC中不同类别化合物分离困难的问题,能在同一时间内完成对多个、多类成分的含量测定3233。中药遵循中医药理论的指导,具有系统性和整体性的特点34。中药质量控制与评价体系的建立应符合整体性观念、精准性理念及系统性思维,仅从单一或一类化学成分来评价淫羊藿药材质量,无法避免地存在局限性,需要建立更加完善的质量标准体系,才能符合中药“多成分、多靶点”起效的特点35。因此,针对淫羊藿多元活性成分的特点,建立多元活性成分同时测定的方法,对探讨多元指标成分的综合评价体系,具有科学性与实用性。为进一步建立淫羊藿
18、药材质量评价综合体系,本文建立了UHPLCQTRAPMS/MS技术同时测定不同采收期箭叶淫羊藿中50种活性成分(黄酮类、生物碱类、酚酸类、氨基酸类和核苷类)含量的方法,综合考察不同采收期箭叶淫羊藿中多元活性成分的动态累积变化,并结合灰色关联度分析(GRA)对不同采收期箭叶淫羊藿样品进行综合评价,为揭示箭叶淫羊藿中多元活性成分的动态累积规律及确定其适宜采收期提供基础数据,同时为淫羊藿药材内在质量的综合评价和全面控制提供新的参考方法。908第 8 期薛佳等:基于UHPLCQTRAPMS/MS的淫羊藿中多元活性成分动态累积的分析与评价1 实验部分 1.1仪器ExionLC超高效液相色谱仪(美国AB
19、SCIEX Instruments);Triple Quad 6500+三重四极杆线性离子阱质谱仪,采用电喷雾离子源,配Analyst 1.7.3软件(美国AB SCIEX Instruments,USA);DFYX300快速多功能粉碎机(温州顶历医疗器械有限公司);XC400C超声波清洗机(济宁鑫欣超声电子设备有限公司);AvantiJ高速离心机(美国贝克曼库尔特公司);ME36S电子分析天平(1/100万,德国赛多利斯公司);FA2204N电子分析天平(1/1万,赛伦仪器)。1.2药品与试剂标准品:山奈酚(中国药品生物制品检定所);紫云英苷(成都德斯特生物技术有限公司);丝氨酸、朝藿定C、
20、苏氨酸、谷氨酸、槲皮苷、脯氨酸、缬氨酸、亮氨酸(中国食品药品检定研究院);组氨酸、脱水淫羊藿素、丙氨酸、胞苷、淫羊藿素、2-脱氧胞苷、酪氨酸、淫羊藿苷、尿苷、木犀草素、肌苷、槲皮素、鸟苷、金丝桃苷、2-脱氧鸟苷、腺苷、木兰花碱、2-脱氧腺苷、绿原酸、2-脱氧肌苷、异亮氨酸、苯丙氨酸(上海源叶生物科技有限公司);新绿原酸、木犀草苷、隐绿原酸(南京景竹生物科技有限公司);朝藿定A、三叶豆苷、朝藿定B、阿福豆苷、2-O-鼠李糖基淫羊藿次苷、淫羊藿新苷、朝藿定A1、箭藿苷A、淫羊藿次苷-、宝藿苷、箭藿苷B、宝藿苷(成都埃法生物科技有限公司);赖氨酸(宝鸡市辰光生物科技有限公司);异槲皮苷(江苏永健医药
21、科技有限公司);芦丁(中国生物制品检定所);以上标准品纯度 98%。乙腈、甲醇、甲酸(色谱纯,德国Merck公司);乙醇(分析纯,南京化学试剂有限公司);实验用水为屈臣氏纯净水。1.3样品不同采收期箭叶淫羊藿样品于2022年3月16日至2022年10月12日实地采集自贵州雷山县丹江镇(北纬N:2622 38.60,东经E:10805 6.56),采收后立即干燥。所有样品经南京中医药大学刘训红教授鉴定为小檗科植物箭叶淫羊藿(Epimedium Sagittatum(Sieb.et Zucc)Maxim)的干燥叶,样品信息见表1。留样凭证存放于南京中医药大学中药鉴定实验室。1.4对照品溶液制备取5
22、0种目标成分对照品适量,精密称定,加60%甲醇溶解并定容至刻度,配制成对照品贮备液。精密量取各对照品贮备液适量于10 mL容量瓶,加60%甲醇定容成混合对照品溶液,用60%甲醇稀释后,得到一系列不同质量浓度的混合对照品溶液,用于后续生成标准曲线。所有混合对照品溶液密封保存于4 冰箱,进入液相系统前经0.22 m滤膜过滤。1.5供试品溶液制备不同采收期箭叶淫羊藿样品用粉碎机粉碎,过50目筛。称取样品粉末约0.5 g于锥形瓶中,加入50%乙醇5 mL,密塞,称定质量,超声提取60 min,冷却至室温后,用50%乙醇补足失重,过滤,滤液以12 000 r/min离心10 min,取上清液,以0.22
23、 m微孔滤膜滤过后储存于4 冰箱中,待测。1.6分析条件1.6.1 色谱条件 色谱柱为Agilent ZORBAX ExtendC18(2.1 mm 100 mm,1.8 m);以水(含0.2%甲酸)为流动相 A,乙腈为流动相 B,柱温 40;流速 0.3 mL/min;进样量 2 L。梯度洗脱:0 表1淫羊藿样品的信息表Table 1Sample information of Epimedii FoliumSampleS1S2S3S4S5S6S7S8Date of harvest2022.03.162022.03.312022.04.152022.04.302022.05.152022.05
24、.302022.06.142022.06.29Batch number00202203160020220331002022041500202204300020220515002022053000202206140020220629SampleS9S10S11S12S13S14S15Date of harvest2022.07.142022.07.292022.08.132022.08.282022.09.122022.09.272022.10.12Batch number00202207140020220729002022081300202208280020220912002022092700
25、20221012909第 42 卷分析测试学报1 min,5%B;1 7 min,5%55%B;7 8 min,55%95%B;8 9 min,95%B;9 9.5 min,95%5%B;9.5 10 min,5%B。1.6.2 质谱条件 使用配有电喷雾电离(ESI)源的Triple Quad 6500+三重四极杆线性离子阱串联质谱仪(AB SCIEX Instruments,USA)进行检测。操作参数如下:离子源温度(TEM)350,雾化器气体(GS1)压力3.79 105 kPa(55 psi);辅助气体(GS2)压力3.79 105 kPa(55 psi);帷幕气体压力3.10 105
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