梨状皮层注射红藻氨酸建立癫痫小鼠模型.pdf
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1、梨状皮层注射红藻氨酸建立癫痫小鼠模型张玲芝,秦滢,吴连连,刘婷隽,陈全刚,胡安康*徐州医科大学实验动物中心,江苏徐州221004摘要 目的:建立和评价梨状皮层微量注射红藻氨酸(kainic acid,KA)激发的癫痫小鼠模型。方法:利用即刻早期基因(cfos)免疫荧光染色技术、原位末端转移酶标记染色(TdTmediated dUTP nickend labeling,TUNEL)技术在急性癫痫小鼠模型中确定癫痫相关脑区梨状皮层。在梨状皮层脑立体定位注射KA后,观察小鼠癫痫发作程度(Racine评分)和癫痫发作潜伏期,行为学实验包括水迷宫检测小鼠学习记忆能力和新物体识别实验检测小鼠探索能力,癫痫
2、发作结果和行为学实验结果均与海马立体定位注射KA的癫痫模型作对比。利用电生理技术检测新模型小鼠神经元电活动。结果:cfos免疫荧光和TUNEL染色结果显示,在急性癫痫小鼠模型中除海马外,梨状皮层脑区神经元也被大量激活,且发生凋亡;在梨状皮层注射KA后成功激发癫痫,与海马注射KA的癫痫模型相比,癫痫发作评分没有显著性差异且发作潜伏期更短;行为学结果显示,梨状皮层注射KA的癫痫模型小鼠空间记忆能力降低,新物体探索能力降低,该结果与海马注射KA的癫痫模型相比无显著性差异;膜片钳实验显示梨状皮层注射KA的癫痫模型神经元放电频率增加、幅值降低、静息膜电位上升。结论:在梨状皮层微量注射KA后成功激发癫痫,
3、这为癫痫发病机制的研究提供了一种新的动物模型。关键词 梨状皮层;海马;癫痫;红藻氨酸;cfos中图分类号 R742.1文献标志码 A文章编号 10074368(2023)08109408doi:10.7655/NYDXBNS20230808Establishing a mouse model of epilepsy via injectin of kainic acid into the pirform contexZHANG Lingzhi,QIN Ying,WU Lianlian,LIU Tingjun,CHEN Quangang,HU Ankang*Laboratory Animal C
4、enter,Xuzhou Medical University,Xuzhou 221004,ChinaAbstract Objective:The current study aims to establish and evaluatee the kindling model of epilepsy induced by kainic acid(KA)microinjection into piriform cortex.Methods:Using cfos immunofluorescence staining and TdTmediated dUTP nickend labeling(TU
5、NEL)staining techniques to find the piriform cortex associated with epilepsy in a acute epilepsy mouse model.Racine score andseizure latency were observed after injection of KA in piriform cortex.Behavioral experiments were performed including testing thelearning and memory abilities of mice in a wa
6、ter maze and the exploration ability of mice in a new object.The results of seizures andbehavioral experiments were compared with the epileptic model of stereotactic injection of KA into the hippocampus.The electricalactivities of new model mouse neurons were measured by electrophysiological techniq
7、ues.Results:The results of c fosimmunofluorescence and TUNEL staining showed that in addition to the hippocampus,neurons in the piriform cortex and hippocampuswere also significantly activated,and apoptosis occurred in the acute epilepsy mouse model.After injecting KA into the piriform cortex,the ep
8、ilepsy was successfully ignited.Compared with the epilepsy model injected KA into the hippocampus,there was no significantdifference in the epileptic seizure score and the seizurelatency was shorter.The behavioral results showed that the epileptic model miceinduced by KA injection into the piriform
9、cortex had a reduced spatial memory ability and a reduced ability to explore new objects.These results showed no significant difference compared to the epileptic model induced by KA injection into the hippocampus.Thepatch clamp recording test showed an increase in firing frequency and the resting me
10、mbrane potential,and a decrease in amplitude ofneuronal discharge.Conclusion:The microinjection of KA into the piriform cortex has successfully induced epilepsy,which mayprovide a new animal model for studying the pathogenesis of epilepsy.Key words piriform cortex;hippocampus;epilepsy;kainic acid;cf
11、osJ Nanjing Med Univ,2023,43(08):10941101基金项目江苏省自然科学基金(BK20170251);江苏省高等学校自然科学基金(21KJB180011);徐州市科技局社会发展项目(ZYSB20210410);江苏省实验动物协会科研基金(DWXH202206);徐州市科技创新重点研发计划面上项目(KC22078)通信作者(Correspondingauthor),Email:基础研究南京医科大学学报(自然科学版)Journal of Nanjing Medical University(Natural Sciences)第43卷第8期2023年8月1094癫痫是
12、一种慢性神经系统疾病,其病理特征是神经元过度或超同步放电1。全球 1%2%的人患有癫痫并影响着全球10%人口的正常生活2。其反复无端发作使患者备受煎熬,给患者及其家人造成了很大困扰。目前癫痫的发病机制暂不明确,但普遍认为是神经元异常放电引起的大脑暂时性生理功能障碍3。内侧颞叶癫痫是成人中最常见的癫痫类型4,据报道,颞叶癫痫患者会发生许多病变,包括海马硬化、细胞死亡5、颗粒细胞分散6和神经胶质增生等。为了模拟颞叶癫痫,研究学者们已经开发了几种癫痫实验模型,包括毛果芸香碱模型、电点燃模型和红藻氨酸(kainic acid,KA)模型等,其中KA癫痫模型被广泛应用于科学研究。KA是一种高亲和力激动剂
13、,主要由红藻氨酸受体的激活发挥作用。KA受体与AMPA受体(amino3hydroxy5methyl4isoxazolepropionic acidreceptor,氨基3羟基5甲基4异恶唑丙酸受体)和 NMDA 受体(NmethylDaspartic acid receptor,N甲基D天冬氨酸受体)一起构成谷氨酸受体的离子型受体家族。天然红藻氨酸受体广泛分布在大脑中7,且在海马区域较为密集。1970 年以来,海马就被认为是与癫痫发作相关的区域8。研究人员将 KA 注射到海马中,发现胶质增生9和细胞凋亡等病理变化,其发病特征也与在人类颞叶癫痫患者中观察到的相似10。因为它能模拟在单侧海马发生
14、硬化的颞叶癫痫病例且死亡率低11,所以海马内给予 KA 诱导的自发性癫痫小鼠模型被科研界广泛应用,成为较成熟的癫痫模型12。梨状皮层与海马结构相似,具有保守发育的三层结构,与边缘和皮层区域有广泛的联系,且拥有与海马体中类似的微电路,提供兴奋、前馈抑制和反馈抑制13-14。容易受到兴奋性毒性损伤,并且与癫痫发作有关15。早在1993年研究显示,在癫痫模型中,海马、杏仁核、嗅球、梨状皮质和内嗅皮质中检测到 cfos 信使 RNA(messengerRNA,mRNA)表达显著增加16。后续研究表明,电刺激梨状皮层也可以产生抗癫痫作用17。但是在人类癫痫研究中,人们大多关注内侧颞叶结构,尤其是海马18
15、,而梨状皮层在癫痫研究中未得到重视。本研究通过与海马注射KA癫痫模型对比,探讨梨状皮层注射KA癫痫模型的可行性及优势。1材料和方法1.1材料8周龄C57BL/6雄鼠,体重2025 g,由徐州医科大学实验动物中心提供。随机分为腹腔注射生理盐水对照组(4只)、腹腔注射15 mg/kg KA组(KA组,4只)、海马注射KA模型组(HiKA组,5只)、海马注射生理盐水对照组(HiCon组5只)、梨状皮层注射KA模型组(PirKA组,30只)和梨状皮层注射生理盐水对照组(PirCon组,10只)。本研究经徐州医科大学伦理批准,实验伦理号:202207S128。KA(K2389,Sigma 公 司,美 国
16、),c fos 抗 体(2250,Cell Signaling Technology 公司,美国),DAPI染 色 液(C1005,上 海 碧 云 天),TUNEL 试 剂 盒(11684795910,罗 氏 公 司,美 国),荧 光 显 微 镜(BX53/DP73,Olympus公司,日本),脑立体定位仪、台式动物手术显微镜(深圳瑞沃德公司),冰冻切片机(Leica公司,德国),微量移液器(Gilson公司,法国),膜片钳放大器(MultiClamp700B,Axon公司,美国),数据采集器(Digidata 1400A,Molecular Devices公司,美国),微操纵器(MPC200
17、,Scientifica公司,英国),硼硅酸玻璃电极(1.2 mm外径,0.69 mm内径)、P97微电极拉制仪拉制(Sutter Instrument公司,美国)1.2方法1.2.1cfos免疫荧光染色小鼠腹腔注射15 mg/kg KA约2 h后,经4%多聚甲醛灌注固定,取脑,固定过夜,经30%蔗糖脱水沉糖。冰冻切片,切片厚25 m,10%山羊血清封闭于37 烘箱 40 min,滴加 cfos 抗体(1 500),4 孵育过夜。PBS 清洗3次,10 min/次,滴加荧光二抗(1 500)孵育1.5 h;PBS清洗3次,10 min/次,DAPI染色10 min;PBS清洗3次,10 min
18、/次,加防荧光淬灭剂封片并于荧光显微镜下观察拍照。1.2.2TUNEL染色冰冻切片25 m 充分晾干,PBS漂洗2次;玻片干后,加50 L TUNEL反应混合液(阴性对照组仅加50 L 2号液)于标本上,加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应37 1 h。PBS漂洗3次后加1滴PBS在荧光显微镜下拍摄。1.2.3模型建立方法小鼠麻醉后固定于立体定位仪上,剪开头皮、暴露颅骨,利用前、后囟调平颅骨,利用玻璃电极连接微量注射器将200 nL KA(1 mg/mL)注射于海马第43卷第8期2023年8月张玲芝,秦滢,吴连连,待.梨状皮层注射红藻氨酸建立癫痫小鼠模型 J.南京医科大学学报(自然科学版),2023
19、,43(8):1094-11011095南京医科大学学报第43卷第8期2023年8月(AP:-2.0,ML:-1.5,DV:-1.5)或梨状皮层(AP:2.2,ML:-2.0,DV:-4.5),注射完成后留针10 min。缓慢拔针并完成缝合。梨状皮层使用剂量为0.1 g、0.2 g和0.4 g,分别立体定位注射200 nL KA(0.5 mg/mL)、200 nLKA(1 mg/mL)和200 nL KA(2 mg/mL)。1.2.4行为学方法1.2.4.1水迷宫前4 d为训练期,分别从水迷宫4个象限将小鼠依次放入。每次训练时间为1 min,1 min内找到平台,使其在平台上停留15 s。若1
20、 min内未找到平台则引导小鼠到达平台并停留 15 s。第 5 天为测试期,撤掉平台,将小鼠从第二象限放入,记录第一次到达平台的时间和到达总次数等信息。1.2.4.2新物体识别第一阶段,在实验装置里放入两个相同物品,并让小鼠自由探索10 min。第二阶段,与第一阶段间隔1 h以上,将其中一个物品换成新物品,再次放入测试小鼠,让其自由探索10 min,完成测试。更换测试小鼠之前,用75%酒精擦拭实验装置。1.2.5电生理记录对照组和处理组小鼠分别使用异氟烷麻醉后,使用20 mL冰冻记录用人工脑脊液(ASCF)灌注小鼠。使用大剪刀迅速断头,取出鼠脑,剥离至预充氧(95%O2+5%CO2)的高糖AS
21、CF中。2 min后取出鼠脑修块,并转移固定到震荡切片机的载脑台上并一起置于切片机的切片槽中,调节刀片角度,迅速将鼠脑切成250 m厚脑片。用吸管将切好的脑片转移至预充氧的32 ASCF中,孵育30 min,然后再转移至室温,稳定至少1 h后开始记录。吸管将孵育好的小鼠脑片转移到充满ASCF的脑片槽中,用缠有尼龙丝的铂金圏压住脑片。采用全细胞膜片钳的方法来记录膜电位和电流诱发的动作电位。玻璃电极灌入电极内液后给予正压,接近细胞后释放正压并用嘴短促地吸气,给予细胞负压,同时用Multi Clamp700B迅速将细胞钳制到-70 mV,等待电极与细胞间形成高阻封接(1 G)。使用 Zap 方式进行
22、破膜,观察破膜后串联电阻 Ra(30 M)和漏电流(-100 pA)的值。对于良好破膜的细胞进行全细胞膜片钳记录。在电流钳模式下,I=0时给予细胞不同电流刺激(步阶,-200 pA+50 pA)以诱发动作电位,刺激时间为500 ms,2次trial间隔为5 s。全细胞记录过程中,观察和记录Ra值,变动范围超过25%的细胞去除。刺激电流为0 pA时,记录的膜电位为细胞静息电位(RMP)。1.3统计学方法应用GraphPad Prism 9.0进行统计学分析,符合正态分布的计量资料,两组比较采用t检验;多组比较采用单因素方差分析或者双因素方差分析。P0.05 为差异有统计学意义。2结果2.1腹腔注
23、射KA的急性癫痫模型中梨状皮层和海马脑区被激活利用经典急性癫痫小鼠模型寻找癫痫相关脑区。在小鼠腹腔注射15 mg/kg KA 2 h后灌注取脑,冰冻切片后进行cfos免疫荧光染色。结果显示,小鼠大脑梨状皮层和海马区域内神经元被大量激活(图1A),cfos阳性细胞数量显著增加(P 0.001,图1B),与海马相比无显著性差异。结果表明,在腹腔注射KA的急性癫痫模型中,梨状皮层和海马脑区一样,神经元会被大量激活。2.2腹腔注射KA的急性癫痫模型中梨状皮层和海马脑区神经元发生凋亡已有研究显示,在KA的刺激下神经元过度激活会对大脑有进一步损伤,造成细胞凋亡19。利用TUNEL检测技术,对急性癫痫小鼠模
24、型的梨状皮层和海马脑区进行凋亡检测(图2A),结果显示,在急性癫痫模型小鼠中梨状皮层和海马脑区的神经元凋亡数量与对照组相比显著增多(P 0.001,图2B)。与海马区域相比,梨状皮层神经元凋亡数量也显著增多(图2B)。这表明梨状皮层和海马脑区的神经元在急性癫痫小鼠模型中都发生凋亡,且梨状皮层神经元凋亡数量比海马显著增多。2.3梨状皮层脑立体定位注射KA的最佳剂量上述结果表明除海马外,梨状皮层神经元在急性癫痫模型中也被大量激活,海马立体定位注射KA的癫痫模型已被广泛应用,于是将KA分别定位注射到小鼠梨状皮层。参考海马立体定位注射KA的癫痫模型使用1 nmol(约0.213 g)KA剂量20,在梨
25、状皮层探索了0.1 g、0.2 g和0.4 g 3种使用剂量,立体定位注射后观察小鼠行为。对小鼠痫性发作强度进行惊厥分级,分级标准采用Racine分级方法:0级,行为正常;级,动须、眼,湿狗样抖动,节律性咀嚼;级,点头,甩尾;级,一侧前肢阵挛;级,双侧前肢阵挛,站立;级,全身阵挛,跌倒。其中Racine 级行为代表了部分点燃,Racine、级行为代表完全点燃。结果显示KA 0.1 g组1096AB*PirConPirKAHiConHiKA2520151050cfos阳性细胞数PirConPirKAHiConHiKAcfosDAPIMergeA:各组cfos荧光染色图(标尺:500 m,4);B
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