南昌市食源性沙门菌多黏菌素耐药基因突变分析.pdf
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1、国外医药抗生素分册2 0 2 3年5月第44卷第3期.145.南昌市食源性沙门菌多黏菌素耐药基因突变分析邓灵,芦晓萍1,翟平平2,李睿1*(1武汉轻工大学生命科学学院,武汉430 0 2 3;2 江西省检验检测认证总院食品检验检测研究院,南昌330 0 0 0)摘要:沙门菌耐药性对人类健康造成巨大威胁。多黏菌素号称人类对抗细菌感染的最后一道防线。本文对南昌市食品源沙门菌分离株进行药敏测定。并将4株多黏菌素耐药株进行三代全基因组测序。比较基因组分析结果表明,4株菌均不携带能导致多黏菌素耐药的基因mcr,但eptC、m i c A 都存在基因突变,PhoP/PhoQ和PmrA/PmrB系统存在的S
2、NP位点可能是导致其耐多黏菌素的原因之一。本文结果为沙门菌耐多黏菌素的机制提供了新的数据参考。关键词:沙门菌;全基因组测序;耐药;多黏菌素;基因突变中图分类号:R978.1文献标志码:A文章编号:10 0 1-8 7 51(2 0 2 3)0 3-0 145-0 5The Mutations of Polymyxin Resistance Genes of Foodborne SalmonellaDeng Ling,Lu Xiao-ping,Zhai Ping-ping,Li Ruil(1 College of Biological and Pharmaceutical Engineering
3、,Wuhan Polytechnic Universitya,Wuhan 430023;2 Jiangxi General Institute of Testing and Certification Food Testing Institute,Nanchang 330000)Abstract:The antimicrobial resistance of Salmonella poses a threat to human health.Polymyxin B is consideredas last-line drug for bacterial infection.In this pa
4、per,four Polymyxin B-resistant Salmonella strains isolated from foodsources were performed third generation whole-genome sequencing.The comparative genome analysis showed thatthe test strains did not carry mcr gene which was associated with polymyxin B resistance.However,the mutationson eptC and mic
5、A were found in the strains.The SNP sites present in PmrA/PmrB and PhoP/PhoQ system may beresponsible for polymyxin B resistance of Salmonella in this paper.The results obtained in this paper provided newdata for polymyxin B resistance research.Key words:Salmonella;whole genome sequencing;antimicrob
6、ial resistance;polymyxin B;gene mutation1引言沙门菌属(Salmonella spp.)是一种常见的食源性致病菌,革兰阴性、兼性、胞内细菌。18 8 5年Salmon和Smith在霍乱流行时分离到猪霍乱沙门菌,故定名为沙门菌属!。在全球,尤其是发展中国家,每年大约有16 0 0 万人感染沙门菌,导致大约6 0 万人死亡2 。在我国,由沙门菌引起的食源性中毒事件在食源性致病菌中毒事件中屡占首位(7 0%8 0%)3。沙门菌感染最常见的原因是食用了被污染的肉、蛋或饮用被污染的牛奶4。随着新一代基因组测序的发展,基于全基因组收稿日期:2 0 2 2-10-2
7、9基金项目:江西省市场监督管理局科技计划项目(GSJK202104)。作者简介:邓灵,研究生,主要从事食品微生物的研究工作。*通讯作者:李睿,教授,主要从事食品微生物与食品安全的研究工作。测序(Genome-wide sequencing,WGS)的分子分型技术在食源性疾病聚集性病例的识别和暴发溯源调查中显示出极大的应用价值和发展潜力5。基于全基因组测序有助于食源性微生物开展遗传与变异、致病与耐药机制及菌种进化等方面的基础研究。通过全基因组测序的结果,可以快速的完成对特异性基因之间比对,了解基因中存在的差异,从而解析耐药与致病机制。沙门菌耐药性根据来源可以分为天然耐药性和获得性耐药性6 。天然
8、耐药性是沙门菌在自然界中赖以生存的一种特有性质;获得性耐药则可能是由于.146.人类长时间在疾病治疗和预防等方面对抗生素的应用不当造成的。多黏菌素是2 0 世纪50 年代发现的一种环肽类抗生素,于1947 年在多黏芽孢杆菌(Bacilluspolymyxa)中发现,对绝大部分革兰阴性细菌具有抗菌活性7 。临床上常用的有多黏菌素B(PolymyxinB)和多黏菌素E(Colistin)。目前,多黏菌素已经成为了治疗多重耐药病原菌引起严重感染的最后一道防线。但随着病原菌的耐药性进一步的加强,世界范围内不断有新的报道称检测出耐多黏菌素的致病菌8 。沙门菌常见的多黏菌素耐药机制有脂多糖修饰、质粒介导的
9、多黏菌素耐药、细菌在不利条件下分泌的多糖物质屏障、外排泵等9。目前国内研究者开展食源性沙门菌耐药性研究时很少测定多黏菌素抗性10-1。但沙门菌临床株多黏菌素耐药性较为常见。浙江大学分析了沙门菌临床株多黏菌素耐药性,其中肠炎沙门菌(S.enteritidis)和鼠伤寒沙门菌(S.typhimurium)多黏菌素耐药率分别高达8 3.9%(125/149)和15.3%(9/59)12 。因此很有必要开展食源性致病菌多黏菌素耐药性监测。本文研究目的就是筛查44株沙门菌食源性菌株多黏菌素的耐药性,再选取代表性耐药菌株进行三代测序,采用比较基因组学技术分析多黏菌素耐药相关的耐药基因SNP突变,为多黏菌素
10、耐药机制研究提供新数据。2材料和方法2.1实验材料样本来源为2 0 2 0 年在江西南昌地区的多个菜市场的冷鲜、现杀或冰冻的鸡肉与猪肉中分离到的44株沙门菌。沙门菌SAL-007(NCBI登录号:CP071686.1)、SA L-0 2 0(CP0 7 16 90.1)、SA L-045(CP071693.1)均分离自2 0 2 0 年食物中毒病人粪便样本。2.2主要试剂多黏菌素B(批号Y26A11H122615,武汉飞扬生物有限公司)、胰蛋白陈(批号2 0 2 2 0 30 3,青岛海博生物公司)、氯化钠(批号2 0 16 110 9,国药集团化学试剂有限公司)、酵母提取物(批号4352 7
11、 8 5-0 2,OXOID)、MH肉汤(批号2 0 2 2 0 6 0 1,青岛海博生物公司)、96 孔细胞培养板(购自武汉华顺生物有限公司)。2.3实验方法2.3.1多黏菌素耐药性测定按照美国临床和实验室标准协会(CLSI)方案13 配World Notes on Antibiotics,2023,Vol.44,No 5制多黏菌素原液,用二倍稀释法对多黏菌素进行梯度稀释,稀释范围为0.12 5、0.2 5、0.5、1、2、4、8、16、32 g/mL。首先将44株沙门菌分批次进行37 过夜培养。于超净工作台分别吸取4mL实验菌株到对应的10 mLEP管中。离心机8 0 0 0 r/min离
12、心5min,去上清液,加入4mLPBS溶液,移液枪吹打至沉淀完全重悬,重复操作2 次。用浊度仪调节细菌菌悬液浓度到0.5麦氏单位(110 CFU/mL)并用MH溶液稀释10 0 倍待用。取96 孔板按标记依次加入不同梯度的多黏菌素稀释液50 L、稀释后菌液50 L混合。阳性对照加入50L稀释后菌液、MH溶液50 L混合。阴性对照加入100LMH溶液。将96 孔板置于生化培养箱,37,避光静置18 2 4h。以肉眼观察到能抑制细菌生长的最低药物浓度为最低抑菌浓度,记录各菌株MIC浓度。大肠埃希菌ATCC25922作为质量控制菌。2.3.2全基因组测序数据分析与挖掘以三代测序数据为主,采用二代测序
13、进行补测及纠错的策略进行全基因组测序。将多黏菌素耐药菌株培养到OD0.6左右收集菌体,放置于EP管中,然后用干冰保存快递到上海美吉生物公司进行Pacbio三代测序。利用SOAPdenovo2组装测序原始序列得到完整的基因组序列。使用PlasmidFinder软件筛查质粒,通过在线工具PlasmidFinder 2.1、M o b i le Ele m e n t Fi n d e r 和PMLST预测质粒类型。使用快速注释网站(RAST,Version2.0)对沙门菌的染色体以及质粒基因进行注释。利用Resfinder(Version4.1)和综合抗生素研究数据库(Comprehensive
14、antibiotic resistance database,CARD)对耐药基因进行预测注释。以上海美吉生物公司与RAST预测的耐药基因为准,用Resfinder和CARD进行校正。对于无法查证的基因则采用NCBI的BLAST进行比对确定。重点筛查mcr基因。然后将测序菌株的多黏菌素耐药基因序列进行Blast分析,查找SNP位点,重点筛查PhoPQ系统和PmrA/PmrB系统相关基因的SNP突变。2.3.3基于CVTree构建进化树利用在线分析软件CVTree3(http:/ 0 2 3年5月第44卷第3期g/mL),有4株对多黏菌素B耐药(MIC4 g/mL),其余菌株为敏感型。菌株A7和
15、A29-2的MIC为32 g/mL,菌株A39的MIC值为8 g/mL,菌株JXY0409-18的MIC值为4 g/mL。3.2全基因组测序数据分析与挖掘将4株多黏菌素耐药株送至上海美吉生物公司进行测序处理。全基因组测序基本信息如测序深度、GC含量、耐药基因种类等参见表1所示。由表1数据可知,4株菌都携带质粒和多种耐药基因。将4株沙门菌的质粒序列输入相关软件预测质粒类型,除了菌株JXY0409-18携带的一个小质粒无法菌株名称质粒数目基因组大小/bpA72A29-23A392JXY0409-418表2 食源性沙门菌质粒类型菌株名称质粒类型A7IncFI(pCRY),Col(pHAD28)A29
16、-2Col4401l,Col156,Col4401A39IncFIB(S),CoIRNAIJXY0409-18IncHI2A,Co l 440 II,Co IRNA I,未分型JXY0409_18A29_2Salmonella enterica subsp.enterica serovar Kentucky strain 161365(CP043664.1)Salmonella enterica subsp.enterica serovar Kentucky strain 162835(CP043667.1)A39Salmonella enterica subsp.enterica serov
17、ar Typhimurium strain SAP17-7699(CP040564.1)Salmonella enterica strain UWI-PS 6 isolate CFSAN103852(CP066328.1)Salmonella enterica subsp.enterica strain CFSAN002003(CP074673.1)图14株沙门菌和参考菌株进化树.147.进行分型外,其他质粒分类结果如表2 所示。4株菌中仅有菌株A7和JXY0409_18携带耐药质粒。其中菌株A7耐药质粒只携带一种耐药基因,即喹诺酮类耐药基因qnrB。A 7、A 2 9-2、A 39的耐药基因
18、主要位于染色体上。菌株JXY0409_18与此相反,染色体仅携带3种耐药基因,如氨基糖苷类耐药基因aac(6)-laa、a a d A 11和-内酰胺类耐药基因ampH,其余2 1种耐药基因都位于质粒上。3.3基于CVTree的进化树分析将4株沙门菌测序株全基因组序列输入到CVTree3,软件将上传的序列和系统内置的细菌序表1食源性沙门菌序列组装信息G+C/%含量测序深度耐药基因种类468765252.22489736552.22499201552.18487756451.78耐药质粒数目1001Salmonella enterica subsp.enterica serovar Give s
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