基于还原型半抗体构建新型冠状病毒检测的电化学免疫传感器.pdf
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1、Advances in Analytical Chemistry 分析化学进展分析化学进展,2023,13(2),134-142 Published Online May 2023 in Hans.https:/www.hanspub.org/journal/aac https:/doi.org/10.12677/aac.2023.132016 文章引用文章引用:徐安安,陈亚芳,周诗梦,赵如良,朱晓霞.基于还原型半抗体构建新型冠状病毒检测的电化学免疫传感器J.分析化学进展,2023,13(2):134-142.DOI:10.12677/aac.2023.132016 基于还原型半抗体构建新型冠
2、状病毒检测的基于还原型半抗体构建新型冠状病毒检测的 电化学免疫传感器电化学免疫传感器 徐安安,陈亚芳,周诗梦,赵如良,朱晓霞徐安安,陈亚芳,周诗梦,赵如良,朱晓霞*南通大学公共卫生学院,江苏 南通 收稿日期:2023年4月9日;录用日期:2023年4月29日;发布日期:2023年5月11日 摘摘 要要 新型冠状病毒新型冠状病毒(SARS-CoV-2)抗原快速检测作为基于核酸的分子生物学检测方法的有益补充,有效提高了抗原快速检测作为基于核酸的分子生物学检测方法的有益补充,有效提高了SARS-CoV-2筛查的效率。本研究以丝网印刷碳电极为基础电极,纳米金沉积电极表面,筛查的效率。本研究以丝网印刷碳
3、电极为基础电极,纳米金沉积电极表面,SARS-CoV-2核核衣壳蛋白衣壳蛋白包被半抗体通过包被半抗体通过Au-S自组装功能化电极自组装功能化电极,SARS-CoV-2核衣壳蛋白核衣壳蛋白检测半抗体和辣根过氧化双标检测半抗体和辣根过氧化双标记纳米金作为放大元。循环伏安法和阻抗谱法表征电极逐步修饰过程,建立记纳米金作为放大元。循环伏安法和阻抗谱法表征电极逐步修饰过程,建立SARS-CoV-2电化学免疫检测电化学免疫检测方法:检测范围方法:检测范围0.0550 pg/mL,最低检测限为,最低检测限为9.04 fg/mL,与全抗体建立的检测方法相比,检测限降与全抗体建立的检测方法相比,检测限降低了低了
4、10倍。批内和批间差异系数均小于倍。批内和批间差异系数均小于9.3%,另外在血清样本中的加标回收率可达,另外在血清样本中的加标回收率可达86%109.4%。以。以上结果表明所构建的电化学免疫分析方法对上结果表明所构建的电化学免疫分析方法对COVID-19诊断具有重要意义。诊断具有重要意义。关键词关键词 还原型还原型半抗体,半抗体,新型冠状病毒新型冠状病毒核衣壳蛋白,电化学免疫核衣壳蛋白,电化学免疫传感器传感器,灵敏度,灵敏度 Development of Electrochemical Immunosensor for SARS-CoV-2 Detection Using Reduced Ha
5、lf-Antibody Fragments Anan Xu,Yafang Chen,Shimeng Zhou,Ruliang Zhao,Xiaoxia Zhu*School of Public Health,Nantong University,Nantong Jiangsu Received:Apr.9th,2023;accepted:Apr.29th,2023;published:May 11th,2023 *通讯作者。徐安安 等 DOI:10.12677/aac.2023.132016 135 分析化学进展 Abstract Rapid antigen tests for diagnos
6、is of SARS-CoV-2 are broadly employed for screening approaches,and have potential to be used as alternatives to standard laboratory-based molecular assays.Here,the electrochemical immune-sensor was constructed on screen-printed carbon electrode depo-sited with gold nanoparticles,and the half-antibod
7、y specific SARS-CoV-2 nucleocapsid protein was self-assembly via Au-S bond formation.The modified SPCEs was characterized with cyclic vol-tammetry(CV)and electrochemical impedance spectroscopy(EIS).The signal was amplified with gold nanoparticles(AuNPs)dual-modified with detecting half-antibody frag
8、ments and horsera-dish peroxidase(HRP).With a sandwich immunoassay format,the obtained electrochemical res-ponses were proportional to the SARS-CoV-2 level in the sample.The proposed assay had a dy-namic range for SARS-CoV-2 NP quantification of 0.0550 pg/mL.With a detection limit of 9.04 fg/mL,whic
9、h was almost 10-fold lower than that obtained using AuNPs/SPCE electrode vs.con-ventional whole antibody.Both the intra-and inter-assay coefficients of variation were less than 9.3%.Moreover,the recovery rates are found to range from 86%to 109.4%in the spiked samples.The results show that the propos
10、ed electrochemical immunoassay is a highly promising approach for COVID-19 diagnosis.Keywords Reduced Half Antibody Fragments,SARS-CoV-2 Nuleocapsid Protein,Electrochemical Immunosensor,Sensitivity Copyright 2023 by author(s)and Hans Publishers Inc.This work is licensed under the Creative Commons At
11、tribution International License(CC BY 4.0).http:/creativecommons.org/licenses/by/4.0/1.引言引言 COVID-19 是一种新兴的高度传染性疾病。新型冠状病毒(SARS-CoV-2)感染的临床症状主要以发热、干咳、乏力为主;重症多发生呼吸困难,快速进展为急性呼吸窘迫综合征,脓毒症休克,甚至出现代谢性酸中毒和出凝血功能障碍等,严重危害人体健康,已成为全球公共卫生问题和社会经济负担1 2。及时对患者进行 SARS-CoV-2 检测对病情诊断和后续治疗十分关键。基于核酸的分子生物学检测方法是目前病毒实验室检测的金标方
12、法。其中,实时荧光定量 PCR(Real-Time Fluorescent Quantitative PCR,qPCR)技术因其灵敏度高、特异性强等特点,是目前 SARS-CoV-2检测最常用的手段之一3 4。但是,基于核酸的分子检测仍存在很多缺点,如:检测成本高、检测耗时长且周转期长;专业性强,实时荧光定量 PCR 技术步骤繁琐,需要专业人员(持证上岗)和专业的 PCR 仪器;检测要求高,标准及规范的基因扩增实验室设置标准分区,各区通风良好,保证整个 PCR 实验过程中试剂和标本免受气溶胶的污染5 6。因此,很难向发展中国家的人们提供大规模检测。基于抗原抗体反应的免疫学分析技术具有检测特异性
13、高和周转时间快等优势,可快速、简便地对症状疑似人员、自我检测需求的人员或从事高风险人员进行筛查,足以弥补实时荧光定量PCR技术的不足,能够作为基于核酸的分子生物学检测方法的有益补充7。目前,SARS-CoV-2 抗原检测已成为SARS-CoV-2 感染诊断的有效参考依据,显著缓解了 SARS-CoV-2 感染大规模人群筛查的压力,有效提高了 SARS-CoV-2 筛查的效率8。Open AccessOpen Access徐安安 等 DOI:10.12677/aac.2023.132016 136 分析化学进展 免疫传感器是一种生物传感器,它因将传统的免疫分析和生物传感技术融为一体,不仅减少了分
14、析时间,提高了灵敏度和测试精度,还简化了抗原检测过程,应用前景广泛9 10。因此,开发用于 SARS-CoV-2 抗原检测的免疫传感器进一步提高 SARS-CoV-2 筛查的效率。然而到目前为止,报道过的各种SARS-CoV-2 传感器除了电极本身电化学性能的差异,还会存在因抗体固定不稳定或因抗体的随机固定导致的抗体活性降低等问题,这些都严重影响了传感器的检测性能11。因此,本研究目的是提供一种基于还原型半抗体定向共价修饰电化学免疫传感器的制备方法,通过夹心法对新型冠状病毒抗原的检测,以解决现有用于 SARS-CoV-2 抗原检测的免疫传感器存在的缺陷。2.实验部分实验部分 2.1.实验试剂与
15、仪器实验试剂与仪器 SARS-CoV-2 核衣壳蛋白标准品(Nucleocapsid,N 蛋白(NP),纯度 96%)、SARS-CoV-2 N 蛋白抗体 Ab1 和 Ab2,安源医药科技(上海)有限公司;HAuCl4、EDTA、2-巯基乙胺盐酸盐、柠檬酸钠、辣根过氧化物酶(HRP)、K3Fe(CN)6、K4Fe(CN)6、KCl、酪蛋白,上海国药集团化学试剂有限公司;BCA 蛋白浓度测定试剂盒、磷酸盐缓冲液(PBS,100 mM,pH 7.0)和 Tris-HCl 缓冲液(0.1 M,pH 8.0)、磷酸柠檬酸底物缓冲液(0.1 M,pH 5.0),上海碧云天生物技术有限公司;丝网印刷碳电极
16、,广州钰芯传感科技有限公司;Centricon Y-30 超滤管,美国 Millipore 公司;试验用水为 Millipore 超纯水(18.2 Mcm)。电化学测试采用 CHI 660D 电化学工作站(上海辰华仪器有限公司),三电极系统:参比电极为银/氯化银电极,辅助电极为铂丝电极。所有电化学实验均在室温条件下进行。2.2.工作电极的准备及修饰工作电极的准备及修饰 将丝网印刷炭电极电极(d=3.0 mm)在无水乙醇和纯水中分别超声清洗 510 min,氮气吹干;将上述清洗过的丝网印刷电极表面滴加 30 L 的 HAuCl4(6.5 mM),扫描范围为1.50.5 V,扫速 50 mV/s,
17、扫描10 次,纳米金(AuNPs)电沉积于 SPCEs 电极表面;氮气吹掉表面残余的 HAuCl4,用超纯水冲洗电极表面,N2吹干,即得到 AuNPs/SPCEs 电极,避光保存备用。2.3.半抗体半抗体 HAb1 的制备的制备 通过还原法制备新型冠状病毒 N 蛋白(NP)的半抗体,具体操作如下11:新型冠状病毒核衣壳蛋白抗体(Ab1)和新型冠状病毒 N 蛋白检测抗体(Ab2)分别用含 10 mM EDTA 的 PBS 分别稀释至 1.0 mg/mL,抗体溶液边搅拌边逐滴滴加三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)至终浓度为 100 mM,混合液在 37避光搅拌反应 1.5 h 后,用 Centr
18、icon Y-30 超滤离心进行纯化,最后将纯化的半抗体 HAb1 和 HAb2 保存在含有 10 mM EDTA 的 PBS(10 mM,pH 7.4),BCA 法测定半抗体浓度,即得可用于本实验的 HAb1 和 HAb2。2.4.纳米金及纳米金双标记纳米金及纳米金双标记 24 mL 柠檬酸钠(2.2 mM)溶液加热至沸腾,迅速加入 1 mL HAuCl4溶液(6.5 mM);继续边搅拌边加热15 min,溶液颜色由灰变紫再变成红色;4,13000 rpm 离心 20 min 收集纳米金,用超纯水洗涤 3 次,最后定容使纳米金溶液吸光值为 1.0。HRP 和 HAb2 双标记纳米金颗粒12,
19、取 1 mL 纳米金溶液用 0.2 mol/L K2CO3调节 pH 至 8.59.0,边搅拌边加入 110 g 还原型半抗体 HAb2 和 110 g HRP,避光,室温搅拌反应 30 min,静置 2 h,加入 100 L 3%BSA 室温继续搅拌反应 30 min,4 13000 rpm 离心 20 min 收集 HRP-AuNP-HAb2 复合物,PBS 洗涤 3 次后并溶于 100 L PBS 溶液中。徐安安 等 DOI:10.12677/aac.2023.132016 137 分析化学进展 2.5.电化学免疫传感器的制备电化学免疫传感器的制备 用含有10 mM EDTA的PBS(1
20、0 mM,pH 7.4)稀释还原型半抗体HAb1至10100 g/mL,取3 L HAb1涂滴于 AuNPs/SPCEs 电极表面,密封容器中 37避光孵育 24 h,吹掉电极表面残留液,取 6 L 1 mM的 2-巯基乙醇(MCH)溶液滴涂电极表面,电极在密封容器里 37孵育 1 h,PBST 清洗电极表面,晾干,即得 MCH/HAb1/AuNPs/SPCEs 电极,将所述电化学免疫传感器置于 4保存备用。2.6.SARS-CoV-2 的测定的测定 用 TRIS-HCl 缓冲液(0.1M,pH 8.0)稀释 SARS-CoV-2NP 标准品至浓度为 0.05、0.1、0.5、1、5、20和
21、50 pg/mL,得到梯度浓度的 NP 抗原稀释液;将 3.0 L 梯度浓度的 NP 稀释液分别滴加在上述所制备的电极上,37孵育 60 min,氮气吹干工作电极表面残留液,PBST 充分洗涤;取 3.0 L HRP-AuNP-HAb2滴加到电极,室温孵育 60 min,PBST 充分洗涤即为待检测的工作电极。以所述工作电极与参比电极和对电极构成三电极体系,将 30 L 磷酸柠檬酸缓冲液(0.1M,pH 5.0)含 TMB-H2O2(TMB 0.8 mM,H2O2 2.0 mM)检测液滴加在待检测的工作电极后;于电压范围 00.4V 下对待检测的工作电极进行差分脉冲伏安。根据获得的电流响应值与
22、不同浓度的 NP 建立的标准曲线。3.实验实验结果结果 3.1.电极修饰原理电极修饰原理 本研究基于夹心法构建 SARS-CoV-2 NP 检测的电化学免疫传感器。SARS-CoV-2 NP 还原型半抗体通过 Au-S 定向共价修饰纳米金沉积的电极表面,得到取向有序的生物活性膜层,保证了抗体的免疫活性,利用抗原抗体反应测试电化学电流响应实现对 SARS-CoV-2 NP 定量分析。电极修饰过程的原理如图 1所示。Figure 1.Schematic representation of the modification of SPCEs 图图 1.电极修饰示意图 3.2.循环伏安表征循环伏安表征
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