乳酸菌素PlnJ第5位氨基酸%28赖氨酸%29定点突变对其热稳定性的影响 (1).pdf
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1、收稿日期:修回日期:基金项目:福建省自然科学基金项目()福建省教育厅中青年教师教育科研项目()作者简介:严梦涵()女 研究方向:动物疾病与保健:.通信作者王全溪()男副教授 研究方向:宿主与病原互作:.乳酸菌素 第 位氨基酸(赖氨酸)定点突变对其热稳定性的影响严梦涵 许丽惠 游泽龙 陆芍华 何 晴 郑 娱 许高琳 王全溪(福建农林大学福建省兽医中药与动物保健重点实验室/中西兽医结合与动物保健福建省高等学校重点实验室福建 福州 )摘要:利用生物信息学软件.分析植物乳酸菌素 的氨基酸序列筛选出最不稳定的氨基酸位点进行定点突变构建点突变重组表达质粒 对点突变重组表达质粒进行原核表达并筛选表达最适条件
2、采用镍亲和层析法纯化重组蛋白 以大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌作为指示菌探究 水浴加热、对重组 抑菌功能的影响 结果表明 第 位氨基酸 赖氨酸()对其稳定性具有重大影响 以人工合成第 位氨基酸即赖氨酸()突变为缬氨酸()的 核苷酸序列作为模板成功构建重组表达质粒 和酶切鉴定结果显示目的条带 测序后证明突变成功 重组蛋白诱导表达条件的优化结果表明:在 、.的最优诱导条件下特异目的蛋白表达显著(.)咪唑洗脱液浓度 是最优洗脱条件可获得较为单一的目的蛋白 采用牛津杯抑菌试验法及麦氏比浊法比较突变前后的 蛋白的抑菌效果结果表明突变后的蛋白()与突变前的蛋白()加热、对大肠杆菌的抑菌效果均差异显著(
3、.)而对沙门氏菌、金黄色葡萄球菌的抑菌效果均差异极显著(.)综上第 位氨基酸即赖氨酸()突变为缬氨酸()后()的热稳定性得到了提高且不改变其抑菌效果开放科学(资源服务)标识码()关键词:乳酸菌素 热稳定性 原核表达 抑菌效果中图分类号:文献标识码:文章编号:():./.(.).()(/):.().().()().福建农林大学学报(自然科学版)第 卷 第 期 ()年 月.()(.)(.)(.).().()().:乳酸菌()是指一类以厌氧发酵葡萄糖产生大量乳酸产物的细菌总称从大部分常见的食品中均可分离提取 乳酸菌在正常生长过程中分泌生产的具有一定抗菌活性的多肽被称为乳酸菌素能够有效抑制多种病原菌
4、一些乳酸菌素不仅可以抑制革兰氏阳性菌如金黄色葡萄球菌()、枯草芽孢杆菌()对革兰氏阴性菌如大肠杆菌()、铜绿假单胞菌()、巴氏杆菌()也有较好的抑制作用 在实际动物疾病防治中乳酸菌素常通过杀灭肠道内致病菌或抑制其生长的方式稳定肠道内部微生物区平衡肠道黏膜中电解质及水分的组成从而维持肠道内微环境的稳定 研究表明乳酸菌素添加于肉仔鸡日粮可显著降低肉仔鸡的料重比提高增重率 乳酸乳球菌素、乳酸片球菌素均能使小鼠肠道内的万古霉素肠球菌的数量下降增强小鼠的肠上皮屏障功能 在奶牛养殖中将乳酸菌素涂于奶牛乳头口处可以有效抑制革兰氏阳性菌的感染预防奶牛乳房炎 乳酸菌素在多种动物疾病治疗中起到了良好的作用其无毒副
5、作用、无残留的特点使其具有良好的医疗应用前景进一步扩展乳酸菌素的应用范围将成为未来重要的研究方向但是乳酸菌素是一类对环境条件要求严格的蛋白其生产及作用效果受菌株类型、培养时间、温度、压力、营养物质成分(如碳源、氮源、磷酸盐等)影响较大 已有研究表明这些因素对乳酸杆菌菌株的生长以及乳酸菌素的合成具有重要影响 当乳酸菌素所处环境温度高于 时其蛋白活性显著降低极易失活从而影响乳酸菌素本身效用的发挥本试验利用生物信息学软件对乳酸菌素 氨基酸序列进行分析、预测以及定点突变不稳定氨基酸构建位点突变重组表达质粒采用基因工程技术构建并体外表达突变重组蛋白定向改造乳酸菌素 的耐热性通过体外抑菌试验初步验证突变后
6、的蛋白()与突变前的蛋白()在 加热不同时间后其抑菌功能的变化 材料与方法.材料乳酸菌素 基因(本实验室前期克隆)、肉汤培养基(拓普生物科技有限公司).感受态细胞、.()感受态细胞、()载体、连接酶、凝胶试剂盒均购于赛默飞世尔科技公司细菌基因 提取试剂盒、质粒小提中量试剂盒、琼脂糖凝胶 快速回收试剂盒均购于天根生化科技(北京)有限公司 、蛋白纯化柱.方法.不稳定氨基酸的筛选 使用.软件对 基因进行预测将 每个氨基酸不同热稳定性结果导出并通过相关自由能变化值对结果进行筛查选择合适的氨基酸将改造后的基因序列交由上海生物工程股份有限公司合成质粒.突变后 蛋白原核表达()引物的设计与合成:参考基因库中
7、乳酸菌(:)基因的核苷酸序列使用 软件对其进行特异性引物设计并人工合成酶切位点为 的上游引物()及酶切位点为 的下游引物()序列(表)引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成()突变后 基因的扩增:以人工合成的突变序列 基因为模板将 基因的上游引物 和下游引物 作为扩增引物对突变后的 基因进行 扩增反应体系为 、.第 期严梦涵等:乳酸菌素 第 位氨基酸(赖氨酸)定点突变对其热稳定性的影响 、模板 、上游与下游引物各 、.使用 将体系添加至 扩增产物用琼脂糖凝胶电泳鉴定检验条带位置是否与预期一致()重组质粒转化:连接产物中加入 感受态细胞 冰浴 放入 的水浴锅中热激 紧接着再次冰浴 加入 未加
8、氨苄西林()的 肉汤(常温状态)将恒温孵育箱调至 振荡孵育 取 菌液涂布于添加 的 固体培养基上放入 恒温培养箱倒置培养过夜次日挑取白色单克隆菌 验证后作为基因模板表 引物序列 引物名称引物序列()酶切位点扩增片段/上游引物:下游引物:上游引物:下游引物:()重组表达质粒的鉴定:将突变后()()重组质粒作为模板以 基因的上游引物 和下游引物 作为扩增引物进行 鉴定将鉴定结果为阳性的()()重组质粒进行双酶切并用琼脂糖凝胶电泳鉴定将符合预期结果的重组质粒送往生物公司测序.突变后 蛋白诱导表达 将突变后()()重组质粒转化至.()感受态细胞中并挑取白色单克隆菌落接种于未加 的 肉汤中将恒温孵育箱调
9、至 振荡孵育至 .将其作为诱导表达模板筛选最适诱导时间:诱导温度为 终浓度为.分别诱导、并将高温变性后的菌液进行 分析筛选最适诱导 终浓度:诱导温度为 诱导时间为 分别加入终浓度为.、.、.、.的 诱导并将高温变性后的菌液进行 分析筛选最适诱导温度:诱导时间为 终浓度为.分别在、进行诱导并将高温变性后的菌液进行 分析筛选最适咪唑洗脱浓度:将诱导后的菌液进行超声破碎并使用 亲和层析柱分别配制、和 咪唑对破碎后的菌液进行洗脱纯化并收集洗脱液进行 分析.纯化后蛋白浓度测定 利用考马斯亮蓝法建立标准曲线测定纯化后的蛋白浓度.突变前后抑菌效果比较 牛津杯抑菌试验:以金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肠沙门氏菌肠
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