基于16S rDNA高通量测序技术研究人参对LPS诱导的抑郁样行为小鼠肠道菌群的影响.pdf
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1、广 东 药 科 大 学 学 报Journal of Guangdong Pharmaceutical UniversityJul,2023,39(4)基于16S rDNA高通量测序技术研究人参对LPS诱导的抑郁样行为小鼠肠道菌群的影响赖文杰1,林淑桢2,刘鸿基2,曾琛悦2,罗丹琪2,黄钰婷2,谢炜城2,马鸿雁2,汤丹2,3,4(1.广东药科大学药学院,广东 广州 510006;2.广东药科大学中药学院,广东 广州 510006;3.国家中医药管理局中药数字化质量评价技术重点研究室,广东 广州 510006;4.广东省中药质量工程技术研究中心,广东 广州 510006)摘要:目的 研究人参对脂多
2、糖(Iipopolysaccaride,LPS)诱导的抑郁样行为小鼠肠道菌群的影响。方法 将小鼠随机分为空白组(Con)、模型组(Mod)、人参水提物组(GS)、盐酸氟西汀组(Flu);给药7 d后,进行旷场实验和悬尾实验,观察小鼠的行为学表现,并使用16S rDNA技术检测各组小鼠粪便肠道菌群变化及预测抑郁样行为小鼠肠道菌群相关的功能通路。结果 与模型组相比,人参水提物组小鼠的活动次数和休息时间明显减少,活动总路程及平均速度显著增加;人参水提物组肠道菌群从门到属水平均发生了变化,部分有益菌的丰度增加,部分有害菌的丰度降低,其中厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌属(Bacteroides
3、)、毛螺菌属(Lachnospiraceae_FCS020_group)、瘤胃菌属(Ruminococcaceae_UCG_009)、Lachnoclostridium菌属显著增多,均有往正常组回调的趋势;KEGG通路富集分析共发现31条功能通路与抑郁样行为小鼠肠道菌群相关。结论 人参具有改善抑郁样行为小鼠肠道菌群失调的作用。关键词:人参;抑郁症;肠道菌群;16S rDNA;短链脂肪酸中图分类号:R285文献标识码:A文章编号:2096-3653(2023)04-0041-08DOI:10.16809/ki.2096-3653.2023040304Effects of ginseng on g
4、ut microbiota of LPS-induced depression-like behavior mice based on 16SrDNA sequencing technologyLAI Wenjie1,LIN Shuzhen2,LIU Hongji2,ZENG Chenyue2,LUO Danqi2,HUANG Yuting2,XIE Weicheng2,MA Hongyan2*,TANG Dan2,3,4*(1.School of Pharmacy,Guangdong Pharmaceutical University,Guangzhou 510006,China.2.Sch
5、ool of Chinese MeteriaMedica Guangdong Pharmaceutical University,Guangzhou 51006,China.3.Key Laboratory of Digital Quality Evaluation ofChinese Materia Medica of State Administration of TCM,Guangzhou 510006,China.3.Technology EngineeringTechnology Research Center for Chinese Materia Medica Quality o
6、f Guangdong Province,Guangzhou 510006,China)*Corresponding author:TANG Dan,Email:;MA Hongyan,Email:Abstract:Objective To study the effect of ginseng on intestinal flora in LPS-induced depression-like behaviormice.Methods The mice were randomly divided into the control group(Con),the model group(Mod)
7、,ginsengaqueous extract group(GS),and fluoxetine hydrochloride group(Flu).Seven days after administration,open-fieldtest and tail suspension test were conducted to observe the behavioral performance of mice,and 16S rDNAsequencing technology was used to detect the change of fecal intestinal flora in
8、mice in each group and predict thefunctional pathways related to intestinal flora in mice with depressive-like behavior.Results Compared with themodel group,the number of activities and rest time of mice in the ginseng aqueous extract group were收稿日期:2023-04-03基金项目:国家自然科学基金项目(82074137);广东省普通高校重点领域专项(
9、2022ZDZX2032);广东省基础与应用基础研究基金(2022A1515220068);广东省大学生创新创业训练计划项目(S202210573050)作者简介:赖文杰(2001),男,本科生,Email:wenjie-通信作者:汤丹(1983),男,博士,副研究员,主要从事中药药效物质基础与作用机制研究,Email:;马鸿雁(1981),女,博士,副教授,主要从事中药质量控制研究,Email:。广东药科大学学报第39卷significantly reduced,and the total activity distance and average velocity were signifi
10、cantly increased.Theintestinal flora of the ginseng aqueous extract group changed from phylum to genus level,and the abundance ofsome beneficial bacteria was increased,while the abundance of some harmful bacteria was decreased.Amongthem,Firmicutes,Bacteroides,Lachnospiraceae_FCS020,Ruminococcaceae_U
11、CG_009,and Lachnoclostridiumincreased significantly,which had a tendency to be adjusted back to the normal group.A total of 31 functionalpathways were found to be associated with the gut microbiota of mice with depressive behavior through KEGGpathway enrichment analysis.Conclusion Ginseng has the ef
12、fect of improving intestinal microbiota imbalance inmice with depressive behavior.Key words:ginseng;depression;gut microbiota;16S rDNA sequencing technology;short-chain fatty acids抑郁症(depression)是当今社会最常见的一种与情感有关的心理疾病,抑郁发作时的主要临床表现为情绪低落、思维迟缓、食欲不振、认知和睡眠障碍等。目前全球抑郁症状患者已超3.5亿名,且仍有上升的趋势1,将在2030年成为全球疾病负担的首位
13、2,其形势严峻不容乐观。从中医角度来讲,抑郁症是由于患者长期脾胃不和、气血瘀滞引起的情志不畅、精神涣散等表现的综合征,与中医学“癫证”“郁证”“賍燥”极为相似。相关研究表明3,宿主的生理健康与肠道菌群的平衡性和多样性息息相关,胃肠道的稳态变化是肠道菌群对宿主产生影响的主要生理途径之一。近年来,越来越多证据显示,抑郁症患者的肠道菌群与健康人群存在显著差异4,肠道菌群可通过“肠-脑”轴来调节中枢神经系统,从而对大脑活动产生影响5,由此可见脾胃与肠道菌群和抑郁症密切相关,这为研究抑郁症发病机制提供了新思路。人参(Panax ginseng C.A.Meyer)五加科多年生草本植物,具有大补元气、益气
14、养血、补虚扶正、安神宁志等功效。现代药理研究表明,其主要含有皂苷、多糖、挥发油等化学成分,具有调节中枢神经系统、强心、抗肿瘤、改善免疫功能等药理活性6-7,除此之外,临床研究证明人参还具有抗抑郁8-9的作用,但目前作用机制不清。人参的健脾益气、和胃止泻、安神宁志等功效与抑郁症病机相互关联。中医学认为正常的脾胃功能是保证肠道菌群稳态的关键,可有效改善抑郁症状。肠道菌群与中医“脾胃”在生理功能上相通,脾主运化,胃主受纳,纳运正常,共同完成饮食水谷精微和津液的消化、吸收,并转输至人体各个脏腑。因此,本研究以脂多糖(lipopolysaccaride,LPS)诱导的抑郁样行为小鼠为研究对象,通过旷场实
15、验(open field test,OFT)、悬尾实验(tail suspension test,TST)等行为学实验评价人参抗抑郁作用,采用16S rDNA测序技术初步研究人参对抑郁模型小鼠肠道菌群的影响,为后续研究提供基础。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 药物人参样品(林下山参),采自吉林抚松,经广东药科大学中药学院马鸿雁副教授鉴定为正品。取100 g人参,用10倍量清水浸泡30 min,煎煮1 h,然后用8倍量清水浸泡饮片30 min,煎煮1 h,共煮2次,过滤,合并2次滤液,最后减压浓缩,冷冻干燥成粉末。1.1.2实验动物24 只 SPF 级雌性 C57BL/6 雄性小鼠,体质量
16、(182)g,4 周龄,购自广东省动物医 学 实 验 中 心,动 物 合 格 证 号:No.44007200087475。饲养于广东药科大学实验动物中心,温度(242),湿度(605)%,自由饮食饮水。所有动物实验均按照中国动物福利法相关规定进行,并经广东药科大学实验动物伦理委员会批准实施(No.gdpulac2017394)。1.1.3主要试剂盐酸氟西汀(批号:F844356,上海麦克林生化科技有限公司);LPS(批号:L2630,Sigma-Aldrich);HiPure Stool DNAKits(批号:D3141,广州美基生物科技有限公司);AxyPrep DNA GelExtract
17、ion Kit(批号:ASJ0013,美国 Axygen Biosciences公司);琼脂糖(批号:111860,西班牙Biowest Agarose公司)。1.1.4主要仪器旷场自主活动仪(广州必特生物科技有限公司);小鼠悬尾实时检测分析系统(广州必特生物科技有限公司);Tanon-2500凝胶成像系统(上海天能科技有限公司);ETC811型PCR仪(北京东胜兴业科学仪器有限公司)。1.2 方法1.2.1动物分组与给药4周龄C57BL/6小鼠适应性喂养7 d,按体质量随机分为空白组(Con)、模型组(Mod)、人参水提物组(GS)和盐酸氟西汀组42第4期 赖文杰,等.基于16S rDNA高
18、通量测序技术研究人参对LPS诱导的抑郁样行为小鼠肠道菌群的影响A.活动次数;B.休息时间;C.总路程;D.平均速度。与Con组比较:#P0.05,#P0.01;与Mod组比较:*P0.05,*P0.01。图1 旷场实验运动情况Figure 1 Open field experiment movement(n=6)(Flu),每组6只,空白组和模型组均灌胃给予生理盐水(0.2 mL/20 g),GS 组灌胃给予人参水提物(5 mg/kg),Flu组灌胃给予盐酸氟西汀(30 mg/kg)。7 d灌胃结束后,给药组小鼠腹腔注射LPS(0.83 mg/kg)构建抑郁症模型,空白组腹腔注射等量生理盐水,
19、24 h后进行旷场、悬尾等行为学实验衡量模型是否建立成功10。1.2.2旷场实验将小鼠放入箱内底面中心,并且开启摄像及计时。观察5 min后停止摄像,在这期间,设备将记录小鼠的运动轨迹及运动时间。每次测试结束后,及时清理小鼠的大小便,并用75%()乙醇清洗方箱内壁及底面,消除气味对下次测试结果的影响。1.2.3 悬尾实验 在小鼠尾部末端1.0 cm处,用胶带将其绑在离地面60 cm的架子边缘,悬吊6 min,期间进行摄像,摄像背景与小鼠毛色呈明显反差,记录下小鼠最后4 min的静止时间。1.2.4收集小鼠肠道内容物行为学实验结束后,禁食不禁水12 h,异氟烷麻醉处死小鼠,取其盲肠内容物,装入冻
20、存管中保存。1.2.5肠道菌群 16S rDNA 测序肠道菌群 16SrDNA测序使用HiPure Stool DNA Kits从小鼠粪便中提取基因组DNA后,对16S rDNA V3+V4区进行扩增,引物序列为341F:CCT ACG GGN GGC WGCAG;806R:GGA CTA CHV GGG TAT CTAAT。PCR产物利用 AxyPrep DNA Gel Extraction Kit 进行纯化,ABI StepOnePlus Real-Time PCR System进行定量,再通过Illumina MiSeq测序平台进行测序,原始数据提交到 NCBI Sequence Rea
21、d Archive(SRA)数据库。最后利用Omicshare云平台完成序列分布与操作分类单元(Operational taxonomic units,OTU)的生成、菌群多样性分析、菌群差异分析和功能预测等数据分析。1.2.6统计学处理采用SPSS 26.0统计软件分析,GraphPad Prism 9.5.0软件作图,实验数据以xs表示,采用单因素方差分析(One-way ANOVA)进行显著性分析,P0.05为差异有统计学意义。2 结果2.1 旷场实验行为学表现在旷场实验中,与空白组比较,模型组的小鼠活动次数与休息时间显著增加(P0.01),运动总路程和平均速度显著下降(P0.01),提
22、示LPS能增加小鼠抑郁样行为,如精神萎靡、焦灼不安、行动迟缓等;与模型组相比,GS组和Flu组小鼠的自主活动行为有明显改善(P0.05,P0.01),表明人参水提物能有效调节小鼠不良情绪,具有抗抑郁效应。见图1。2.2 悬尾实验行为学表现悬尾实验能反映出小鼠在绝望时的自主活动1007650250活动次数/次ABCD1251007650250休息时间/s#*15.012.510.57.55.02.50.0平均速度/(cms-1)5 0004 0003 0002 0001 0000ConModGSFluConModGSFluConModGSFluConModGSFlu总路程/cm43广东药科大学学
23、报第39卷行为。与空白组比较,模型组的相对静止时间延长,运动时间缩短,差异具有统计学意义(P0.01),提示小鼠经LPS处理后行动迟缓且少动,产生绝望的抑郁样行为;与模型组相比,GS组小鼠的活动能力明显改善(P0.05,P0.01),表明人参水提物能预防 LPS 诱导的抑郁样行为,增加小鼠的求生欲望。见图2。2.3 序列分布与操作分类单元本研究各个样本序列分布为 201478 bp,与16S rDNA 的 V3-V4 区序列长度吻合,可用于后续分析。操作分类单元(operational taxonomic units,OTU),是人为利用Effective tages之间的序列相似性聚类成不同
24、的分类单元,以便于生物学分析工作的进行,通常在97%的相似度下将Effective tages序列聚类生成OTU11。本研究生成的各样本OTU数量范围为1 2821 575。2.4 稀释曲线和Alpha多样性分析稀释曲线主要反映微生物在不同测序深度的物种丰富程度。由图3可知,测序样本肠道菌群的稀释曲线随着测序深度的增加而变缓,表明肠道菌群中的物种没有随着测序样品数量的增加而增加,测序深度几乎覆盖样品中的所有物种。Alpha多样性可用于评估一个特定区域或生态系统内的多样性。结果显示各组菌群均具有较高A.相对静止时间;B.运动时间。与Con组比较:#P0.01;与Mod组比较:*P0.05,*P0
25、.01。图2 悬尾试验Figure 2 Tail suspension test(n=6)A.Shannon指数曲线;B.Simpson指数曲线;C.ACE指数曲线;D.Good s Coverage指数曲线。图3 稀释曲线Figure 3 Dilution curveA3002001000相对静止时间/s#*ConModGSFluConModGSFlu#*B运动时间/s15010050076543210ABCDOTU水平下的Shannon指数OTU水平下的ACE指数2 2002 0001 8001 6001 4001 2001 000800600400200040 00020 000测序样本
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