狗尾草转酮醇酶抑制剂筛选方法的构建与应用.pdf
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1、第 46 卷第 4 期2023 年 7 月河 北 农 业 大 学 学 报JOURNAL OF HEBEI AGRICULTURAL UNIVERSITYVol.46 No.4Jul.2 0 2 3收稿日期:2023-05-10基金项目:国家自然科学基金资助项目(31871981).第一作者:郑 宇(1996),男,河北邯郸人,硕士研究生,从事杂草研究工作.E-mail:通信作者:张金林(1968),男,河北香河人,博士,教授,从事农药学的教学和科研工作.E-mail:本刊网址:http:/文章编号:1000-1573(2023)04-0098-06DOI:10.13320/ki.jauh.20
2、23.0064狗尾草转酮醇酶抑制剂筛选方法的构建与应用郑 宇1,王 帅1,栗猛超1,杨冬臣1,王彦恩2,张金林1(1.河北农业大学 植物保护学院,河北 保定 071000;2.河北农业大学 理学院,河北 保定 071000)摘要:为开发以转酮醇酶为靶标的新型除草剂,本研究以转酮醇酶为研究对象,通过 PCR 扩增技术,克隆狗尾草转酮醇酶基因,经酶切,连接等方法构建原核表达载体,琼脂糖凝胶电泳检测蛋白大小符合理论预测数值,经测序验证序列正确。通过原核表达技术获得狗尾草转酮醇酶蛋白,经 SDS-PAGE 电泳验证蛋白无误。采用pH-based 法进行酶活测定,评价不同药剂处理下酶活抑制率,筛选得到
3、RD194、ZBW3、ZBW39、ZBW34 和ZBW11 5 种药剂,酶活抑制率分别为 81.25%、93.75%、81.25%、96.88%和 87.50%,优于其它药剂;通过荧光定量 PCR 实验验证筛选,结果显示,除 RD194 外,其余 4 种药剂均使转酮醇酶基因转录水平显著上调,与预期一致。本研究构建了 1 种快速筛选转酮醇酶潜在抑制剂的方法,为靶向开发新型除草剂奠定重要基础。关 键 词:转酮醇酶;原核表达;荧光定量 PCR;药剂筛选中图分类号:S482.1 开放科学(资源服务)标识码(OSID):文献标志码:AConstruction and application of scr
4、eening method for inhibitors against Transketolase from Setaria viridisZHENGYu1,WANGShuai1,LIMengchao1,YANGDongchen1,WANGYanen2,ZHANGJinlin1(1.College of Plant Protection,Hebei Agricultural University,Baoding 071000,China;2.College of Science,Hebei Agricultural University,Baoding 071000,China)Abstra
5、ct:In order to develop new herbicides against a new target Transketolase,the Transketolase gene of Setaria viridis was cloned through PCR amplification and expressed with the prokaryotic expression system.The protein size was consistent with the expected value in the agarose gel of electrophoresis,a
6、nd the sequence was confirmed by sequencing.The Transketolase protein of Setaria viridis was obtained by prokaryotic expression technology,and was verified by SDS-PAGE electrophoresis.The pH based method was used for enzyme activity determination to evaluate the enzyme activity inhibition rate under
7、 different drug treatments.Five drugs RD194,ZBW3,ZBW39,ZBW34,and ZBW11 were selected with enzyme activity inhibition rates of 81.25%,93.75%,81.25%,96.88%and 87.50%,respectively.The screening results were verified by fluorescence quantitative PCR experiment.The data showed that except RD194,four agen
8、ts significantly increased the transcription level of Transketolase gene,which was consistent with expectations.In this paper,a rapid screening method for potential inhibitors of Transketolase was established,which laid an important foundation for targeted development of new herbicides.Keywords:tran
9、sketolase;prokaryotic expression;fluorescence quantitative PCR;drug screening99第 4 期杂草与农作物争抢水份、营养、光和空气,严重损害粮食作物的生产和品质,给农作物生产带来重大损失。除草剂的应用解决了这一难题,为农业生产提供了保障。然而随着除草剂的不合理使用,杂草的除草剂抗性问题随之而来,现已有百余种抗性杂草被报道1-2,抗性产生的原因则分为氨基酸突变、蛋白表达量增大、促进代谢作用等多种抗性机理3-7。新型高效、环境友好农药的开发需求越发迫切8-11。转酮醇酶是 1 种潜在的除草剂靶标,广泛存在于各种动物、植物、微
10、生物之中,此蛋白对植物生长发育起着重要调控作用12-14。本课题组以转酮醇酶为靶标进行了较为深入的研究。本实验室前期从黄顶菊中分离出一种作用于转酮醇酶靶标的除草活性物质-三联噻吩15,并通过双向电泳技术和处理缺陷型拟南芥突变体检测对-三联噻吩的敏感性证实了拟南芥 AT3G60750 蛋白为其作用靶点,并通过虚拟筛选的方法,以转酮醇酶为药剂靶点,对化合物数据库进行过筛,再配合活性测定进行验证,筛选出了 1 个具有除草活性的新化合物。以这种化合物为基础,拓展合成出了一系列新型除草剂,得到了除草效果更佳的转酮醇酶抑制剂,为新农药的发现奠定了基础16-19。但是,目前以转酮醇酶为靶标的除草活性分子的研
11、究报道还很少,因此,以该酶为靶标开发新型除草剂具有很好的创新性20-21。本研究以狗尾草为试验材料,扩增获得其转酮醇酶基因并进行原核表达,对 Yi D 等22离体转酮醇酶蛋白的酶活检测方法进行改进,通过药剂与蛋白互作试验及其验证试验,构建 1 种快速大量筛选转酮醇酶特异性抑制剂的方法,以期为开发新型除草剂奠定基础。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 供试植株及菌株 狗尾草(Setaria viridis)、大肠杆菌 DH5 感受态、大肠杆菌 Rosetta(DE3)感受态细胞、pET28a 原核表达载体由河北农业大学植物保护学院农药系提供。1.1.2供试试剂植物 RNA 快速提取试剂盒购自北
12、京博迈德基因技术有限公司;DNA 分子量标准与蛋白分子量标准购自索莱宝科技有限公司;引物合成及基因测序由生物工程(上海)有限公司完成;转酮醇酶辅因子的竞争性抑制剂对羟基苯丙酮酸(HPP)和阴性对照药吡唑醚菌酯购自上海源叶生物科技有限公司;医药领域的转酮醇酶抑制剂隐丹参酮购自上海笛柏生物科技有限公司;本试验合成衍生化合物合 40 种。1.2 狗尾草转酮醇酶的原核表达1.2.1 狗尾草的培育 先把自来水和营养土混匀,121 灭菌 30 min,待土放凉至室温,装至直径 10 cm 花盆中 3/5 处,选取健康、饱满的狗尾草种子,每个花盆植入 10 粒,覆土 2 cm 左右,加水调节湿度,于人工气候
13、室培养,保证室内温度为 26,光照适宜,适时补水,保持湿度超过 50%最适宜种子萌发。1.2.2 狗尾草转酮醇酶基因的提取 采用液氮研磨法获取狗尾草叶片裂解液上清后,依据生工植物总RNA 快速提取试剂盒进行狗尾草 RNA 的提取。按照康为世纪反转录试剂盒并结合实验略作调整进行cDNA 第一条链的合成。1.2.3 狗尾草转酮醇酶基因的克隆 PCR 基因扩增:根据转酮醇酶蛋白 CDS 基因序列以及 pET28a 的多克隆位点,利用 DNAMAN 软件设计出转酮醇酶蛋白的特异引物 PrimerF-Ned I 和 PrimerR-Bam H I,以狗尾草的 cDNA 为模板进行扩增,结束之后即可得到转
14、酮醇酶蛋白的 CDS 基因序列。1.2.4 狗尾草转酮醇酶表达载体的构建 将扩增得到的转酮醇酶基因片段和 pET28a 载体片段进行双酶切(Nde I,Bam H I)并连接,连接产物,采用热激法将其转入 E.coli DH5a 感受态细胞中,将转化后的感受态细胞加入 500 L LB 培养基,然后 220 r/min,37,活化 1 h,摇菌期间提前将 LB 平板(含有 50 g/mL 的卡那霉素)配置好放凉,将100 L 活化后的菌液涂布到含卡那霉素的 LB 平板上,37 倒置培养 16 h 左右。培养完成后,从中挑取阳性单克隆,进行菌落 PCR 验证后提取质粒。命名重组质粒为 pET28
15、a-TKL。1.2.5 转酮醇酶的原核表达与纯化 将转入重组载体pET28a-TKL 的大肠杆菌 Rosetta 在 37,220 r/min 条件下培养至 OD600 0.6;在培养基中分别加入IPTG 0.1 0.6 mmol/L 进行最佳诱导条件筛选,经过低温 16 诱导 16 h 后进行菌体的富集与破碎从而获得粗蛋白液;粗蛋白液通过镍柱纯化,使用含有不同浓度咪唑的缓冲液进行洗脱,配合 SDS-PAGE 凝胶电泳技术,确定蛋白最佳洗脱浓度,并郑 宇,等:狗尾草转酮醇酶抑制剂筛选方法的构建与应用100第 46 卷河 北 农 业 大 学 学 报得到目的蛋白纯化液。1.2.6 转酮醇酶纯化液的
16、酶活试验前处理 取蛋白纯化液进行超滤,通过不断加入三乙醇胺缓冲液,除去咪唑,并同时将蛋白液的溶剂由洗脱液更换为三乙醇胺缓冲液。可用酚红指示剂检测蛋白浓缩液pH 情况,由此判断咪唑是否去除完毕。完成脱盐和溶剂更换后,根据所需蛋白浓度对超滤浓缩液进行稀释即可用于酶活检测。1.3 狗尾草转酮醇酶与药剂的分子互作研究1.3.1 酶活检测方法的构建 参考 Yi D 等22的转酮醇酶酶活检测方法进行优化,基于 pH 值进行酶活检测。转酮醇酶酶活测定体系(200 L)为:适量转酮醇酶、D-甘油醛 200 mmol/L、TPP 2.4 mmol/L、MgCl2 9.0 mmol/L、三 羟 基 乙 醇 胺 2
17、.0 mmol/L(pH=7.5)和酚红 0.028 mmol/L,振荡混匀。最后加入-羟基丙酮酸锂 50 mmol/L,在 30 条件下启动反应,且在 10 s 内使用酶标仪测定 560 nm 处吸光值,利用酶标仪每隔 10 s 读 1 次,检测 HCO3随时间变化导致的吸光度变化,以此表征酶活的强弱。HCO3标准曲线的制作是通过滴定不同浓度NaHCO3(0 0.8 mmol/L)完成的。为了定量解释吸光度与产物 HCO3浓度之间的关系,将随时间变化的吸光度数据代入 HCO3校准曲线,转换为HCO3的绝对浓度。根据下方公式(1),利用合成曲线的斜率来计算 TKL 的比酶活。1 U 被定义为在
18、分析条件下,每分钟产生 1 mmol HCO3所需的转酮醇酶的量。比酶活U/mg=斜率103M/s 60 s 200 10-6L 酶量mg 公式(1)1.3.2 转酮醇酶筛选药剂体系的构建 将上述酶活检测方法应用于以转酮醇酶为靶标的特异性药剂的筛选,首先将纯化蛋白与上述供试药剂(药剂终浓度 2 mg/L,溶剂为丙酮)在 30 孵育 15 min,然后再将不同处理的蛋白进行酶活检测,设空白对照与溶剂对照,每个处理重复 3 次。将不同药剂处理后的蛋白进行酶活测定,根据80 s 时的OD560值数据,计算 HCO3-浓度,与空白对照作对比,计算酶活抑制率。药剂处理后的比酶活(U/mg)=药剂处理后
19、80 s 时的 HCO3-浓度/空白对照 80 s 时 HCO3-浓度 空白对照的比酶活。比酶活抑制率=(空白对照比酶活-药剂处理的比酶活)/空白对照的比酶活 100%。本试验以丙酮为溶剂,设置转酮醇酶底物的竞争性抑制剂对羟基苯丙酮酸(HPP)为阳性对照药剂,医学领域针对人类转酮醇酶的抑制剂隐丹参酮为阴性对照药,另外增加广谱除草剂烟嘧磺隆、广谱杀菌剂吡唑醚菌酯为阴性对照药,用以验证本方法是否具有良好的特异性。1.3.3 筛选出的药剂的反向验证 利用实时荧光定量 PCR 技术分析药剂对狗尾草转酮醇酶转录水平表达量的影响,将筛选出的抑制效果良好化合物对狗尾草叶片进行茎叶喷雾处理(终浓度为 200
20、mg/L,溶剂为丙酮),6 h 后剪取叶片提总 RNA,经反转录得到 cDNA 后,进行荧光定量 PCR 分析,反应条件:95 预变性 5 min;95 变性 10 s,60 退火30 s,共 40 个循环。每个模板 3 次重复,试验重复3 次。其目的基因为狗尾 TKL,内参基因为 Actin,并利用 2 Ct公式计算方法来进行结果分析。所用引物如表 1 所示。表 1 本研究中所用引物序列Table 1 Primer sequences used in this study引物名称Primer name引物序列Primer sequencePrimerF-Ned ICCATATGAAGGCGG
21、CGAACTCGTGGAPrimerR-Bam H IAGGATCCTCACAAGCTCCTGGCAGCTQTKLFTGGAACAGCGAGGAGAAAQTKLRGGGTGAGCAGTGGGAAAAQACTFCTTCCAGCCATCTTTCATTQACTRCCAGACTCGTCGTACTCAG2 结果与分析2.1 狗尾草转酮醇酶的原核表达以狗尾草 cDNA 为模板,利用 PCR 扩增转酮醇酶基因,得到转酮醇酶完整基因片段。使用限制性内切酶 Ned I 和 Bam H I 对转酮醇酶基因片段和表达载体 pET28a 进行双酶切,经 T4 连接酶连接重组,转化到 DH5 感受态后挑选阳性克隆,菌液
22、 PCR验证如图 1a 所示。pET28a-TKL 质粒送测序结果显示序列无误。将 pET28a-TKL 质粒转化 Rosetta 感受态,并将构建好的表达菌株在37 下培养,经诱导条件筛选,确定在 OD600 0.6 时加入终浓度为 0.1 mmol/L 的IPTG,低温 16 诱导 16 h 为最佳诱导条件,然后101第 4 期进行纯化,用分别含有 50、100、300 和 500 mmol/L 咪唑的 Tris-HCL 洗脱液进行洗脱,SDS-PAGE 电泳检测如图 1b 所示,得到与预期相符的目的蛋白,大小约为 86 kD。bp5 0003 0002 0001 5001 0007505
23、002501002 331 bpa:表达载体菌液 PCR 验证。kD245180135100756348352586 kDb:转酮醇酶蛋白纯化。注:b 图中 1 4 号泳道分别表示含 50、100、300、500 mmol/L 咪唑的蛋白洗脱液。图 1 转酮醇酶蛋白的原核表达Fig.1 Prokaryotic expression gel map of Transketolase protein2.2 酶活测定体系的构建及药剂对酶活的影响通过滴定试验结果数据,绘制 NaHCO3测定标准曲线如图 2a 所示,NaHCO3标准曲线表达式为y=0.108 49x-0.000 32,R2=0.998
24、04。原核表达的野生型转酮醇酶蛋白在酶活测定体系中吸光度差值随时间变化如下图 2b 所示。将吸光度差值数据代入HCO3校准曲线公式,得到转酮醇酶蛋白酶活标准曲线如图 2c 所示,得到转酮醇酶的酶活标准曲线为y=0.003 50 x-0.018 34,R2=0.959 59。由转酮醇酶的酶活标准曲线的斜率计算得到转酮醇酶的比活力为:1.4 U/mg,与 Yi D 等人的研究中同样以 D-甘油醛为受体底物时转酮醇酶的酶活力处于同一水平22,说明本试验中转酮醇酶活性良好,可用于转酮醇酶抑制剂筛选。a:HCO3标准曲线b:吸光度差值随时间变化c:酶活标准曲线图 2 酶活体系构建各数据曲线Fig.2 C
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