发根农杆菌介导的闽楠遗传转化体系构建与优化.pdf
《发根农杆菌介导的闽楠遗传转化体系构建与优化.pdf》由会员分享,可在线阅读,更多相关《发根农杆菌介导的闽楠遗传转化体系构建与优化.pdf(7页珍藏版)》请在咨信网上搜索。
1、1516核农学报2 0 2 3,37(8):1516 152 2Journal of NuclearAgricultural Sciences文章编号:10 0 0-8 551(2 0 2 3)0 8-1516-0 7发根农杆菌介导的闽楠遗传转化体系构建与优化吴梦洁!洪家都1李芳燕1周生财2林二培1程龙军1,*(浙江农林大学林业与生物技术学院/亚热带森林培育国家重点实验室,浙江杭州311300;丽水职业技术学院,浙江丽水323000)摘要:闽楠Phoebe bournei(H e ms l.)Ya n g 为我国重要的珍贵树种。为建立闽楠遗传转化体系,以闽楠幼苗为材料,利用pCAMBIA130
2、0-GFP质粒转化的发根农杆菌介导植株转化。在比较注射和菌液浸泡两种侵染方式侵染效率的基础上,进一步利用正交L9(3)试验从菌株种类、菌液侵染浓度和侵染植株苗龄三个方面优化了遗传转化体系。另外,对不同光强影响闽楠毛状根诱导及转化率情况进行了分析。结果表明,注射法的毛状根诱导率和遗传转化率分别为8 0.0%、6 6.7%;而菌液浸泡法的诱导率和遗传转化率分别为41.2%、35.3%。正交试验中,影响闽楠毛状根诱导率和遗传转化率的主要因素为菌株种类。最大诱导率和转化效率分别达到了8 7.5%、7 0.6%。该体系的最优组合为:K599菌株在菌液浓度0 D60=1.2条件下注射侵染三叶期的闽楠幼苗。
3、此外,较弱光强(50 molm.s))的培养条件比较强光照(10 0 molms)更有利于闽楠幼苗的生长和遗传转化。本研究创建并优化了一套高效、稳定的闽楠遗传转化体系,成功获得了具有转基因毛状根的闽楠植株,为闽楠重要基因挖掘、新种质创建和遗传改良奠定了基础。关键词:闽楠;遗传转化;发根农杆菌D0I:10.11869/j.issn.1000-8551.2023.08.1516闽楠属于樟科(Lauraceae)楠属(Phoebe)植物,是我国重要的珍贵树种。闽楠的木材材质坚韧,是上等建筑和家具的优良木材原料2 ;同时,其树体高大通直,枝繁叶茂,树形优美,是优良的园林绿化树种。但由于气候环境变化和人
4、为砍伐等因素,闽楠资源大量减少,目前仅在江西、福建、浙江、广东、广西、湖南、湖北和贵州呈零星分布3,被列为国家二级珍稀渐危种4。随着国家对珍贵树种种质资源保护和栽培利用的重视,楠木人工培育及应用推广已进入快速发展阶段。生产中对楠木优良品种的需求也越来越大,但木本植物传统育种方式周期较长,应用现代分子辅助育种技术成为了突破传统林木育种瓶颈的一个重要手段5。目前,楠木中的闽楠基因组测序已经完成,其研究开始迈人分子生物学水平6 。但闽楠尚未建立完善的遗传转化体系,限制了其重要经济性状相关的遗传研究。建立一套稳定的遗传转化体系对楠木的遗传研究和育种工作具有重要意义。发根农杆菌(Agrobacteriu
5、mrhizogenes)是一类宿主范围广泛的革兰氏阴性菌,属根瘤菌科(Rhizobiaceae)农杆菌属(Agrobacterium)。其Ri质粒上的T-DNA片段能在植物基因组中插入、整合并表达,诱导植物产生转基因毛状根7 ,是植物遗传转化的一种重要手段8 。发根农杆菌诱导产生的毛状根具有生长速度快,生理生化和遗传性稳定等优点9,遗传转化后的毛状根可以进行植物基因功能和次生代谢等方面的研究10-11,,目前该技术已在多个物种中得到应用12-13。一些植物甚至可以在发根基础上进行植株再生,获得完整转基因植株,如棉花(Gossypium hirsutum)14)葵藜首(Medicagotrunc
6、atula)15、紫花首(Medicago sativa L.)16 等,从而实现培育和创制新种质。基于此,本研究利用非组培依赖的发根农杆菌诱导转化,通过研究侵染方法、农杆菌菌株、菌液浓度和植株苗龄对闽楠毛状根诱导率和遗传转化率的影响,建立并优化闽楠的遗传转化体系,以期为闽楠分子水平上的遗传研究提供良好的技术基础。1材料与方法1.1材料与设备闽楠种子采集自浙江省庆元县实验林场楠木种子收稿日期:2 0 2 2-10-0 1接受日期:2 0 2 2-12-2 7基金项目:浙江省重点研发计划项目(2 0 2 1C02054)作者简介:吴梦洁,女,主要从事林木分子遗传学研究。E-mail:w u me
7、 n g j i e s t u.z a f u.e d u.c n“通讯作者:程龙军,男,副教授,主要从事植物分子遗传学研究。E-mail:l j c h e n g z j u.e d u.c n期的闽楠幼菊株为K599.菌液浓度0 D.=0.8束后取出用纸多余菌液。两种处理的材料为二叶侵染部位及根5min,结针扎幼苗种子上方0 1cm的上胚轴部分5处,随后将分,每株注射月注射器或细取侵染液注射到幼m处的上胚轴部侵染方法选择(1)注射法:用5mL注射器抽1517发根农杆菌介导的闽楠遗传转化体系构建与优化8期园。K599、C58 C1、M SU 440 菌株购自上海唯地生物技术有限公司。pC
8、AMBIA1300-GFP载体保存于浙江农林大学国家重点实验室超低温冰箱。闽楠幼苗培养于MC1000微气候控制生长箱(Snijders,荷兰),基质成分体积占比为:50%泥炭土(1 10 mm),2 5%珍珠岩(36mm),25%蛭石(1 3 mm)。1.2闽楠种子储存将采集的成熟闽楠果实去掉果皮,清洗干净,阳光下晾晒至表面无水分附着。按重量比1:5的比例,将种子与干净湿河沙(湿度约为6 0%)混合均匀装人网纱袋,放人带盖泡沫箱,并用保鲜膜封好,4冰箱冷藏。每两周打开泡沫箱检查河沙湿度,喷壶喷洒适量水进行保湿,尽量保持湿度与初始沙藏时一致。沙藏时间为3个月。1.3闽楠种子播种与幼苗培养闽楠种子
9、播种于湿度为7 0%的湿河沙中,播种深度1cm左右,播种后喷水湿润,在盆上方覆盖保鲜膜进行保湿,育苗盆置于湿度7 0%、温度2 6/2 2(昼/夜)、光照16 h/黑暗8 h、光照强度为50 molm.s的培养箱中,每2 d喷洒适量水,保证种子萌发和幼苗生长过程的水分和湿度。1.4发根农杆菌转化从超低温冰箱中取出K599、C58 C1和MSU440的发根农杆菌感受态于冰上融化,每10 0 L感受态加人1g以pCAMBIA1300为骨架含35S:GFP的载体质粒,吹打混匀后依次置于冰上静置5min,液氮5min,37 水浴5min,冰浴5min。冰浴后加人7 0 0 L无抗生素的Luria-Be
10、rtani(LB)液体培养基,2 8 振荡培养2 h,6000rmin离心1min,留取10 0 L左右的上清并轻轻吹打混匀菌液,涂布于含50 mgL链霉素和50 mgLl卡那霉素的固体LB平板(LB液体培养基加15mgL-l琼脂),2 8 倒置培养2 3d。挑取单克隆于6 0 0 L含50mgL链霉素和50 mgL-卡那霉素的液体LB培养基中,2 8 2 0 0 rmin振荡培养过夜。第2 天进行菌液PCR,鉴定结果正确后,吸取50 0 L菌液加50 0 L50%甘油,保存于-8 0 冰箱。1.5侵染液制备从-8 0 冰箱中取出已转化的发根农杆菌菌液,在含链霉素和卡那霉素的固体LB平板上划线
11、活化,2 8 倒置培养2 3d。挑取单克隆于10 mL含50 mgLl链霉素和50 mgL-1卡那霉素的液体LB培养基中,2 8 下200rmin振荡培养14h,然后吸取2 0 0 L加人到50 mL含链霉素和卡那霉素的液体LB培养基,2 8 2 0 0 rminl振荡培养至菌液浓度以光密度(opticaldensity,O D)表示 0 D6oo=0.8,将培养好的菌液于室温下47 2 2 g离心10 min,倒掉上清,加入等体积重悬液:10 mmol-L-1MgCl,100mmol-L乙酰丁香酮(acetosyringone,AS),2-吗啉乙磺酸(2-morpholinoethanesu
12、lf-onic acid,MES)调pH值至5.2,制备成侵染液1.6闽楠植株的遗传转化6001.6.2共培养及毛状根诱导侵染后把幼苗移栽到已吸满水的基质中,侵染部位要被基质覆盖,并盖上育苗盘的透明保湿塑料罩,在温度2 6/2 2(昼/夜)、湿度7 0%、黑暗条件下共培养2 d。共培养后进行毛状根的诱导培养,条件为温度2 6/2 2(昼/夜)、光照16 h/黑暗8 h、光照强度50 molm2.s。诱导期间,全程用育苗盘的透明保湿塑料罩覆盖进行保湿,培养一周后可打开罩子的通气孔,诱导培养45d。诱导期间,每周浇灌促根营养液一次,促根营养液为1/4Hoaglands营养液基础上添加0.1mgL的
13、1-萘乙酸(naphaleneaceticacid,NA A),以基质充分吸收营养液为标准,育苗盘中不留多余水分。1.6.3毛状根和转基因根的鉴定及统计分析计数成功诱导毛状根的植株,用LUYOR-3415型便携式荧光蛋白激发光源(LUYOR,美国)筛选含有绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein,G FP)荧光的植株,并在SZX7荧光体视显微镜(奥林巴斯,日本)下观察、拍照。提取转基因根和未进行遗传转化根的DNA,以GFP基因为目标基因进行PCR验证。根据载体序列合成GFP引物:上游引物(5 3):TTCCATTGCCCAGCTATCTGTCACT;下游引物(5 一3):T
14、CTTGTAGTTGCCGTCGTCCTTGAA。分子水平验证中,PCR反应体系共2 5L:1.1XT3PCRMix(T SE0 30,北京擎科)2 2 L、上下游引物各1L、D NA 模板1L。PCR反应程序为:98 预变性3min,98 变性10 s,55退火2 0 s,7 2 延伸40 s,35个循环;7 2 再延伸10min,4保存。对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,有大小正确(7 2 0 bp)的目的条带即为阳性植株。诱导率和转化率计算公式如下:诱导率=(毛状根植株数/侵染植株数)10 0%;转化率=(阳性植株数/侵染植株数)10 0%151837卷报核农学1.6.4闽楠转基因植株培养
15、将转基因植株转移到1/4Hoaglands营养液进行水培,或在基质中继续培养,每周浇灌促根营养液1次。转基因根系发育充分后去除非转化的根系,继续培养得到具转基因毛状根系的闽楠植株。1.7闽楠遗传转化体系的优化根据试验过程中可能影响转化率情况的观察,对转化体系进行优化,针对菌株种类、菌液浓度和苗龄(苗龄分为一叶期、二叶期、三叶期,三个时期对应的时间分别为播种后40、45、50 d)开展三因素三水平的正交试验(表1),设计L9(33)正交试验表(表2),每个处理2 0 株苗,侵染方法采用注射法。对试验结果进行统计,并利用SPSS16.0软件进行极差分析和方差分析,筛选出影响闽楠遗传转化的关键因素,
16、从而优化遗传转化体系。表1三因素三水平表Table1Three factors and three levels table水平菌株种类A菌液浓度(OD600)B苗龄CLevelsStrain types Bacterial solution concentration(ODo)Seedling age1K5990.4一叶期2C58C10.8二叶期3MSU4401.2三叶期表2 三因素三水平正交试验设计表Table2Three factors and three levels of orthogonalexperimental design table处理数菌液浓度(OD600)B菌株种类A苗
17、龄CNumberofBacterial solutionStraintypesSeedling ageexperimentsconcentration(ODsoo)1K5990.4一叶期2K5990.8三叶期3K5991.2二叶期4C58C10.4三叶期5C58C10.8二叶期6C58C11.2一叶期7MSU4400.4二叶期8MSU4400.8一叶期9MSU4401.2三叶期1.8不同光照强度对闽楠遗传转化体系的影响根据闽楠幼苗生长环境及生长状态的观察,针对幼苗培养条件和遗传转化过程中的光照强度,对幼苗的管理条件进行优化。设置对照组的光强为50mol.m.s,处理组的光强为10 0 molm
18、.s。其他试验条件相同,均采用菌液浓度OD6oo=0.8的K599菌株,注射法侵染苗龄为三叶期的闽楠幼苗。1.9数据处理利用SPSS16.0软件对试验数据进行处理。并进行极差分析和方差分析,P 苗龄 菌液浓度。菌株种类中,三个菌株在三个水平下诱导率的均值大小为:MSU440(80.5%)K599(75.7%)C58C1(46.4%)。三个菌株在三个水平下转化率的均值大小为:K599(60.5%)MSU440(20.6%)C58C1(1.75%)。M SU 440和K599的诱导率较高,但K599的转化率均值明显高于MSU440。在菌液浓度的三个水平中,菌液浓度为0.8的诱导率均值最大,菌液浓度
19、为1.2 的转化率均值最大。苗龄为二叶期和三叶期的诱导率和转化率均值1519发根农杆菌介导的闽楠遗传转化体系构建与优化8期表4正交试验结果的极差分析Table 4Range analysis of orthogonal test results极差分析水平因素FactorsRange analysisLevelABC诱导率极差分析0.757 30.652.00.5883Range analysis ofk20.464 00.73000.7217inductionefficiency30.805 00.644 30.716 3R0.34100.08570.133 3转化率极差分析0.605 00
20、.224.50.1797Rangeanalysis ofk20.017 50.26870.3020transformation efficiencyk30.206 00.33530.3469R0.58750.110 80.167 2注:h为各因素在各水平下的诱导率和转化率的均值;R为极差。Note:k is the mean value of induction efficiency and transformationefficiency of each factor at each level.R is range.相近且大于一叶期。进一步进行方差分析发现(表5、6),菌株种类对毛状根诱导
21、率和遗传转化率影响最大且达到显著水平(P 0.0 5),苗龄和菌液浓度对诱导率和转化率的影响不显著。根据对正交试验的极差分析结果可得,诱导率高的最佳处理条件为:MSU440菌株、菌液浓度OD6o0=0.8、苗龄为二叶期;转化率高的最佳处理条件为:K599菌株、菌液浓度OD6oo=1.2、苗龄为三叶期。表5菌种、菌液浓度和苗龄对诱导率的方差分析Table 5Variance analysis of strain types,bacterial solutionconcentration and seedling stage on induction efficiency方差来源离差平方和自由度均
22、方F值P值SourceSumof squaresdfMean squareFvaluePvalueA0.20520.10288.8440.011B0.01320.0075.8540.146C0.03420.01714.8470.063表6菌种、菌液浓度和苗龄对转化率的方差分析Table 6Variance analysis of strain types,bacterial solutionconcentration and seedling stage on transformation efficiency方差来源离差平方和自由度均方F值P值SourceSum of squaresdfMe
23、an squareFvaluePvalueA0.54020.27093.0210.011B0.01920.0093.2170.237C0.04520.0227.7430.1142.3闽楠转基因毛状根的鉴定先通过便携式荧光蛋白激发光源对转基因毛状根进行筛选,有绿色荧光信号的毛状根进一步利用荧光体视显微镜进行观察。结果表明,成功被发根农杆菌诱导、转化的毛状根能被激发出明显的CFP荧光信号(图1-A、B)。提取毛状根DNA进行分子鉴定,利用GFP特异引物对DNA进行扩增,转基因毛状根提取的DNA能扩增出GFP基因特异产物,而未转化植株的根DNA无法扩增出GFP特异产物(图1-C)。将转化成功的植株进
24、行培养,即可获得生长正常的含转基因毛状根的闽楠植株(图1-D、E)。BTRTRCKCKCMarkerCKTRD1234bp20001000750500250100注:A:体视显微镜自然光下的根,比例尺为2 mm;B:体视显微镜荧光蛋白检测器激发下的根,比例尺为2 mm;C转基因根的GFP基因片段检测;D:自然光下含转基因毛状根的闽楠植株,比例尺为5cm;E:便携式荧光蛋白检测器激发下含转基因毛状根的闽楠植株,比例尺为5cm。CK指未转化植株的根,TR指转基因毛状根。箭头所指的是转基因毛状根。Note:A:Roots under natural light of stereomicroscope
25、,the scale bar is 2 mm.B:Roots stimulated by fluorescence protein detector under stereomicroscope,the scale bar is 2 mm.C:GFP gene fragment detection of transgenic roots.D:Transgenic composite plants under natural light,the scale bar is 5 cm.E:Transgenic composite plants stimulated by portable fluor
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 发根 杆菌 遗传 转化 体系 构建 优化
1、咨信平台为文档C2C交易模式,即用户上传的文档直接被用户下载,收益归上传人(含作者)所有;本站仅是提供信息存储空间和展示预览,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对上载内容不做任何修改或编辑。所展示的作品文档包括内容和图片全部来源于网络用户和作者上传投稿,我们不确定上传用户享有完全著作权,根据《信息网络传播权保护条例》,如果侵犯了您的版权、权益或隐私,请联系我们,核实后会尽快下架及时删除,并可随时和客服了解处理情况,尊重保护知识产权我们共同努力。
2、文档的总页数、文档格式和文档大小以系统显示为准(内容中显示的页数不一定正确),网站客服只以系统显示的页数、文件格式、文档大小作为仲裁依据,平台无法对文档的真实性、完整性、权威性、准确性、专业性及其观点立场做任何保证或承诺,下载前须认真查看,确认无误后再购买,务必慎重购买;若有违法违纪将进行移交司法处理,若涉侵权平台将进行基本处罚并下架。
3、本站所有内容均由用户上传,付费前请自行鉴别,如您付费,意味着您已接受本站规则且自行承担风险,本站不进行额外附加服务,虚拟产品一经售出概不退款(未进行购买下载可退充值款),文档一经付费(服务费)、不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
4、如你看到网页展示的文档有www.zixin.com.cn水印,是因预览和防盗链等技术需要对页面进行转换压缩成图而已,我们并不对上传的文档进行任何编辑或修改,文档下载后都不会有水印标识(原文档上传前个别存留的除外),下载后原文更清晰;试题试卷类文档,如果标题没有明确说明有答案则都视为没有答案,请知晓;PPT和DOC文档可被视为“模板”,允许上传人保留章节、目录结构的情况下删减部份的内容;PDF文档不管是原文档转换或图片扫描而得,本站不作要求视为允许,下载前自行私信或留言给上传者【自信****多点】。
5、本文档所展示的图片、画像、字体、音乐的版权可能需版权方额外授权,请谨慎使用;网站提供的党政主题相关内容(国旗、国徽、党徽--等)目的在于配合国家政策宣传,仅限个人学习分享使用,禁止用于任何广告和商用目的。
6、文档遇到问题,请及时私信或留言给本站上传会员【自信****多点】,需本站解决可联系【 微信客服】、【 QQ客服】,若有其他问题请点击或扫码反馈【 服务填表】;文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“【 版权申诉】”(推荐),意见反馈和侵权处理邮箱:1219186828@qq.com;也可以拔打客服电话:4008-655-100;投诉/维权电话:4009-655-100。