不同剂量环磷酰胺对雏鸡法氏囊免疫抑制的影响.pdf
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1、不同剂量环磷酰胺对雏鸡法氏囊免疫抑制的影响李冰心1,李婉雁1,曹楠1,杨保和2,袁明凤2,付新亮1,陈文斌1,田允波1,黄运茂1,许丹宁1*(1.仲恺农业工程学院动物科技学院,广东 广州 510225;2.云南快大多畜牧科技有限公司,云南 玉溪 653100)摘 要:该研究旨在探究不同剂量环磷酰胺(CTX)对岭南黄鸡法氏囊免疫抑制的影响,为后续探究如何提高法氏囊免疫力提供动物模型参考。该试验将120只1日龄岭南黄鸡随机分成4组(对照组、CTX20组、CTX40组和CTX80组),每组3个重复,每个重复10只。所有组饲喂基础日粮,CTX20组、CTX40组和CTX80组雏鸡在19、20、21日龄
2、时分别肌肉注射20、40、80 mg/kg BW的CTX,对照组注射等量的生理盐水,最后一次注射7天后,每组随机选取15只雏鸡无菌采集法氏囊和血清进行组织学观察、Tunel检测、实时荧光定量PCR和ELISA检测。组织学观察结果显示,CTX处理可以诱导法氏囊小结间空隙增大、髓质中细胞密度降低、髓质区纤维增生、细胞核溶解、核固缩、坏死细胞数量增加等现象。Tunel检测结果显示,CTX可以诱导法氏囊细胞凋亡(P0.05),其中CTX40组内细胞凋亡率超过35%。实时荧光定量PCR检测结果显示,CTX处理可以诱导法氏囊内细胞凋亡相关基因Bcl2和NFB mRNA表达量显著降低,TNF和Caspase
3、3 mRNA表达量显著上升(P0.05)。血清ELISA检测结果显示,与对照组相比,CTX 处理可以诱导 TNF 和 IFN 表达量显著上升,IL2 和 IL6 表达量显著降低(P0.05)。上述结果表明,该试验成功构建了雏鸡法氏囊免疫抑制模型,其中40 mg/kg CTX免疫抑制效果最优。关键词:环磷酰胺;岭南黄鸡;法氏囊;免疫抑制中图分类号:S859.7文献标识码:A文章编码:10058567(2023)04000706Effects of Cyclophosphamide at Different Doses onImmunosuppression of Chicken Bursa of
4、 FabriciusLI Bingxin1,LI Wanyan1,CAO Nan1,YANG Baohe2,YUAN Mingfeng2,FU Xinliang1,CHEN Wenbin1,TIANYunbo1,HUANG Yunmao1,XU Danning1*(1.College of Animal Science&Technology,Zhongkai University of Agriculture and Engineering,GuangzhouGuangdong 510225;2.Yunnan Kuoduo Animal Husbandry Technology Co.,Ltd
5、.,Yuxi Yunnan 653100)Abstract:The purpose of this study was to explore the effect of different doses of cyclophosphamide(CTX)onthe immunosuppression of the bursa of Fabricius in Lingnan yellow chickensand to provide an animal model referencefor further research on how to improve the immunity of the
6、bursa of Fabricius.In this study,120 1dayold Lingnan收稿日期:20230223基金项目:国家自然科学基金项目(NO.32102747和NO.32202764);广东省自然科学基金面上项目(2022A1515010677);湖南省自然科学基金面上项目(2021JJ30312)作者简介:李冰心(1995年生),博士,讲师,研究方向为动物营养与免疫。Email:*通讯作者:许丹宁(1978年生),博士,教授,研究方向为动物营养与免疫。Email:Guangdong Journal of Animal And Veterinary ScienceDO
7、I:10.19978/ki.xmsy.2023.04.02广东畜牧兽医科技广东畜牧兽医科技2023年(第48卷)第4期试验研究 7试验研究不同剂量环磷酰胺对雏鸡法氏囊免疫抑制的影响李冰心,等法氏囊作为禽类特有的中枢免疫器官,其内部的淋巴囊泡为B细胞分化、发育和成熟提供了必要的微环境12。由于法氏囊在B细胞发育和免疫球蛋白产生中的重要性,法氏囊切除或病理变化将导致体液免疫功能明显下降,增加禽类感染的易感性34。同时,法氏囊大小和重量也会禽类免疫力56。幼畜因其免疫系统尚未发育完善,非常容易受到外界环境的影响,导致其免疫功能低下78。因此,如何提高雏鸡免疫力一直是鸡养殖业的研究难点之一。环磷酰胺(
8、Cyclophosphamide,CTX)起初是一种用于治疗恶性肿瘤和自身免疫疾病的化疗药物9。但是,近年来CTX作为烷化剂的免疫抑制剂,因其效果稳定和作用范围广等优点被广泛应用于免疫抑制动物模型制备10。本课题组前期研究发现,CTX可以成功构建雏鹅胸腺和雏鸡肝脏免疫抑制模型1112。但是CTX对雏鸡法氏囊免疫功能的影响尚不清楚。据此,本试验拟通过肌肉注射不同剂量的CTX,检测其对雏鸡法氏囊组织结构、细胞凋亡和免疫相关细胞因子表达的影响,从而掌握CTX对雏鸡法氏囊免疫功能的影响,为后续探究如何提高法氏囊免疫力提供参考。1材料与方法1.1主要试剂与仪器注射用环磷酰胺(国药准字:H32020857
9、,江苏恒瑞医药股份有限公司,中国);苏木精伊红染色试剂盒、生理盐水、4%多聚甲醛溶液、Tunel检测试剂盒(碧云天生物技术有限公司,中国);白细胞介素2(Interleukin2,IL2)、IL4、IL6、干扰素(Interferon,INF)、肿瘤坏死因子(Tumornecrosis factor,TNF)ELISA试剂盒(上海心语生物科技有限公司,中国);预混型定量反转录试剂盒(TaKaRa公司,日本);实时荧光定量PCR染液(Thermo Fisher公司,美国);引物由北京擎科生物科技有限公司合成。超低温冰箱(Thermo Fisher公司,美国);多功能 梯 度 PCR 仪、实 时
10、荧 光 定 量 PCR 仪(LifeTechnologies,美国);超微量分光光度计、全波长酶标仪(BioTek Instruments公司,美国);超薄切片机、倒置荧光显微镜(Leica公司,德国)。1.2试验分组与处理120只1日龄快大型岭南黄鸡(公母各半)被随机分为 4 组(对照组、20 mg/kg CTX 组、40 mg/kgCTX组、80 mg/kg CTX组),每组3个重复,每个重复10只。养殖期间各组饲养管理条件一致,自由釆食和饮水。在第19、20、21日龄时,CTX处理组yellow chickens were randomly divided into 4 groups(C
11、ontrol group,CTX20 group,CTX40 group,and CTX80group)with 3 replicates per group and 10 in each replicate.All groups were fed with basic diet.The chickens in theCTX20,CTX40,and CTX80 groups were intramuscularly injected with 20,40,and 80 mg/kg BW of CTX at 19,20,and 21 days of age,and the control gro
12、up was injected with the same amount of normal saline.Seven days after the lastinjection,15 chicks from each group were randomly selected to collect the bursa of Fabricius and serum forhistological observation,Tunel,real time fluorescence quantitative PCR,and ELISA detection.The histologicalresults
13、showed that CTX treatment could induce the increase of space between the nodules of the bursa of Fabricius,the decrease of cell density in the medullary tissue,fibroplasia in the medullary region,the dissolution of the nucleus,the pyknosis of the nucleus,and the increase of necrotic cells.The Tunel
14、test results showed that CTX could induceapoptosis of bursa cells(P0.05),and the apoptosis rate in the CTX40 group was more than 35%.The results of realtime fluorescence quantitative PCR showed that the apoptosisrelated genes expressions of Bcl2 and NFB weresignificantly decreased,and the mRNA expre
15、ssions of TNF and Caspase3 were significantly increased in the bursaof Fabricius by CTX treatment(P0.05).The results of serum ELISA showed that compared with the control group,the expression level of TNF and IFN was significantly increased,and the expression level of IL2 and IL6 wassignificantly dec
16、reased(P0.05).These results indicate that the immunosuppression model of the chicken bursae ofFabricius was successfully constructed in this study,and 40 mg/kg CTX had the best effect.Keywords:Cyclophosphamide;Lingnan yellow chicken;Bursa of Fabricius;Immunosuppression 8不同剂量环磷酰胺对雏鸡法氏囊免疫抑制的影响李冰心,等试验研
17、究依据体重(body weight,BW)分别肌肉注射20、40、80 mg/kg BW 的 CTX,对照组注射等量的生理盐水,最后一次注射7天后,每组随机选取15只雏鸡无菌采集法氏囊和血清,冷冻样品储存于-80 超低温冰箱。1.3法氏囊组织学观察1.3.1苏木精伊红染色观察法氏囊于4%多聚甲醛溶液固定48 h后,经过脱水、石蜡包埋制成5 m切片,随后切片经二甲苯脱蜡、梯度酒精水化、苏木精伊红染色,封片后于光学显微镜下进行法氏囊组织结构观察(n=3)。1.3.2透射电镜观察先将1 mm3的雏鸡法氏囊组织于2.5%的戊二醛溶液固定24 h,随后通过锇酸固定、树脂包埋、超薄切片、铅铀双染色后于透射
18、电镜下观察CTX对雏鸡法氏囊超微组织结构的影响(n=3)。1.4细胞凋亡检测将本实验得到的石蜡切片经脱蜡、水化和蛋白酶K处理后,在组织区域加入50 L Tunel检测液,37 避光孵育1 h,随后使用倒置荧光显微镜观察CTX对法氏囊细胞凋亡的影响(n=3)。1.5实时荧光定量PCR检测首先,使用Trizol试剂分别提取各组雏鸡法氏囊组织总RNA(n=5)。根据TaKaRa反转录试剂盒说明,将总 RNA 反转录成 cDNA。以 cDNA 为模板,使用 SYBR Green Master Mix PCR 试剂盒于ABI PRISM 7500系统中进行实时荧光定量PCR检测,采用2-Ct法分析各基因
19、的表达水平。Primer 6软件被用于设计引物,内参基因为GAPDH,引物序列见表1。1.6细胞因子检测各组分别取100 L血清,使用ELISA试剂盒检测CTX对雏鸡血清中TNF、IFN、IL2和IL6表达的影响(n=8)。1.7数据分析所有数据以平均值标准差表示。运用SPSS26.0进行单因素方差分析和Tukey检验,随后使用Graphpad Prism 9.0将数据可视化。P0.05代表差异具有显著性。2结果与分析2.1CTX对雏鸡法氏囊组织结构的影响石蜡切片观察结果显示,对照组雏鸡法氏囊发育良好,组织结构完整,法氏囊小结排列紧凑有序,皮质区、中间层及髓质区界限清晰,皮质区可见大量核浓染的
20、中、小淋巴细胞。与对照组相比,CTX20组内法氏囊小结体积明显减小,皮质层变薄,髓质中细胞密度降低;CTX40组内法氏囊小结间空隙明显增大,部分小结皮髓分界不清晰,皮质区淋巴细胞形态不规则,体积较大,核淡染,髓质区纤维增生现象明显;CTX80组内法氏囊小结之间有严重的纤维增生现象,皮质层所占比例明显降低(图1)。透射电镜观察结果显示,对照组雏鸡法氏囊组织结构完整,低倍镜下可见较多的中淋巴和小淋巴细胞,核周光滑,核内异染色质较多,高倍镜下可见淋巴细胞胞浆内含有大量的粗面内质网和线粒体等,细胞器结构完整。与对照组相比,CTX20组内法氏囊内细胞密度未发生明显变化,但淋巴细胞核内电子密度降低,细胞凋
21、亡现象明显上升,出现了细胞核溶解等现象;CTX40组内法氏囊内细胞间间隙明显增大,细胞密度降低,细胞核内异染色质聚集成大块状,核固缩变小并开始溶解消失,坏死细胞数量明显增加;CTX80组内法氏囊细胞破坏最为严重,细胞密度进一步降低,细胞核内核仁消失,核固缩、核分解现象增多,部分细胞内容物消失(图2)。2.2CTX对法氏囊细胞凋亡的影响为探究CTX对雏鸡法氏囊细胞凋亡的影响,本实验采用Tunel法检测了法氏囊内细胞凋亡情况。结果显示,对照组、CTX20 组、CTX40 组和表1特异性引物序列基因Bcl2Caspase3TNFNFBGAPDH上游引物序列(5 3)TGGATGACCGAGTACCT
22、GAAGCCAGGAAACTTGAACTCATGACCAGATGGGAAGGGAATGAGCATCCTGAACTTGGCTATCTTGAAAGTCGGAGTCAACGGAT下游引物序列(5 3)CCTCATACTGTTGCCGTACAAGCATAGACACAATGCATGGAACGGGTTGCTGCACATACACTGCTGCCTGGCGAATAATACGCTCCTGGAAGATAGTGAT 9CTX80 组内细胞凋亡率分别为 8.29%、26.76%、36.80%、22.21%;与对照组相比,CTX处理组内细胞凋亡率均显著上升(P0.05),其中CTX40组内细胞凋亡率最高(图3)。2.3C
23、TX对法氏囊免疫抑制损伤相关基因表达的影响为了进一步探究CTX对雏鸡法氏囊免疫抑制损伤的影响,本实验通过实时荧光定量PCR检测了法氏囊中4个细胞凋亡相关基因的表达情况。结果显示,与对照组相比,CTX处理组内Bcl2和NFB mRNA 表达量均显著降低,其中 Bcl2mRNA表达量呈剂量依赖性降低,CTX40组内NFB mRNA表达量最低;Caspase3 mRNA表达量均显著上升(P0.05),其中 CTX40 组内表达量最高。对照组CTX20组CTX40组CTX80组15005000注:黑色箭头:核内电子密度降低;蓝色箭头:凋亡小体;黄色箭头:细胞核溶解;绿色箭头:细胞核固缩;白色箭头:细胞
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