表面增强拉曼光谱方法在细菌检测中的研究进展.pdf
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1、第 卷第期光散射学报V o l N o 年月THEJ OUR NA LO FL I GHTS C A T T E R I NGJ u n 文章编号:()收稿日期:,修改日期:基金项目:基金支持:安徽省重点研究与开发计划项目(N o d )、国家自然科学基金(N o )、北京市现场物证检验工程技术研究中心开放课题(N o C S E E K F K T )通讯作者:林东岳,(),男,副研究员,主要研究方向:拉曼光谱技术及其在细菌及毒物等检测研究.E m a i l:d y l i n i i m a c c n表面增强拉曼光谱方法在细菌检测中的研究进展孟治材,林东岳,杨良保(安徽大学,安徽合肥
2、;中国科学院合肥物质科学研究院健康所医学物理技术中心,安徽合肥 )摘要:表面增强拉曼光谱(S u r f a c e e n h a n c e dR a m a ns p e c t r o s c o p y,S E R S)是一种高灵敏度和高选择性的分析方法,能够在复杂样品环境中对目标物进行定性甚至定量分析,近年来在细菌检测领域得到了广泛的应用.S E R S方法通过表面增强效应和拉曼散射效应的协同作用,能够实现对微量细菌的检测,并且具有快速、高灵敏、无损伤等优点.本文介绍了S E R S方法的基本原理和在细菌检测领域的应用.综述了S E R S方法在细菌检测中的两种策略,包括标记法(l
3、 a b e l b a s e d)和无标记法(l a b e l f r e e)的最新研究进展.最后,本文评估了S E R S方法在细菌检测领域存在的挑战和应用的前景,为进一步推动S E R S方法在细菌检测领域的应用提供参考.关键词:表面增强拉曼光谱;细菌检测;标记法;无标记法;基底中图分类号:O 文献标志码:Ad o i:/j i s s n R e s e a r c hP r o g r e s so fS u r f a c e e n h a n c e dR a m a nS p e c t r o s c o p y i nB a c t e r i a lD e t e
4、 c t i o nME NGZ h i c a i,L I ND o n g y u e,YANGL i a n g b a o(A n h u iU n i v e r s i t y,A n h u i,H e f e i ,C h i n a;C e n t e r o fM e d i c a lP h y s i c sT e c h n o l o g y,I n s t i t u t e o fH e a l t h,H e f e i I n s t i t u t e s o fP h y s i c a lS c i e n c e,C h i n e s eA c a
5、 d e m yo fS c i e n c e s,H e f e i ,C h i n a)A b s t r a c t:S u r f a c e e n h a n c e dR a m a ns p e c t r o s c o p y(S E R S)i sah i g h l ys e n s i t i v ea n ds e l e c t i v ea n a l y t i c a lm e t h o dt h a t e n a b l e sq u a l i t a t i v ea n de v e nq u a n t i t a t i v ea n a
6、 l y s i so f t a r g e ts u b s t a n c e si nc o m p l e xs a m p l ee n v i r o n m e n t s I nr e c e n ty e a r s,i th a sb e e nw i d e l ya p p l i e d i nb a c t e r i a l d e t e c t i o nd u e t o i t sa d v a n t a g e so f r a p i dd e t e c t i o n,h i g hs e n s i t i v i t y,a n dn o
7、n d e s t r u c t i v ea n a l y s i s B yu t i l i z i n gt h es y n e r g i s t i ce f f e c to fs u r f a c ee n h a n c e m e n ta n dR a m a ns c a t t e r i n g,S E R Sc a nd e t e c t t r a c ea m o u n t so fb a c t e r i a T h i sa r t i c l e i n t r o d u c e s t h eb a s i cp r i n c i p
8、 l eo fS E R Sa n di t sa p p l i c a t i o ni nb a c t e r i a ld e t e c t i o n T h el a t e s tr e s e a r c hp r o g r e s so ft w os t r a t e g i e s,l a b e l b a s e da n d l a b e l f r e e,b a s e do nS E R S t e c h n o l o g y i nb a c t e r i a l d e t e c t i o na r e s u mm a r i z e
9、 d F i n a l l y,t h i s a r t i c l ee v a l u a t e s t h e c h a l l e n g e s a n dp r o s p e c t so fS E R St e c h n o l o g y i nt h e f i e l do fb a c t e r i a l d e t e c t i o n,p r o v i d i n gar e f e r e n c e f o r f u r t h e rp r o m o t i o no f i t sa p p l i c a t i o n K e yw
10、 o r d s:S E R S;B a c t e r i a l d e t e c t i o n;L a b e l b a s e d;L a b e l f r e e;S u b s t r a t e引言随着社会的发展,由细菌引起的食源性疾病已成为一个严重的问题.世界上每年有数以亿计的人们因被病原细菌污染的食物和水而患病.因此在公共卫生、食品安全、医疗诊断领域迫切的需第期孟治材:表面增强拉曼光谱方法在细菌检测中的研究进展要发展一种快速、稳定、可靠的细菌检测技术.目前,最常用的细菌检测方法主要有平板培养法、比色 法,、流 式 细 胞 术、聚 合 酶 链 式 反 应(P C R)、
11、和酶联免疫吸附测定(E L I S A).这些方法具有较高特异性和准确性的特点,但同时也需要复杂的前处理操作步骤和较长的检测时间.表面增强拉曼光谱(S u r f a c e e n h a n c e dR a m a ns p e c t r o s c o p y,S E R S)是一种强大的光谱分析方法,在检测化学物质、爆炸物、疾病标志物等方面具有很强的能力 .S E R S方法是基于拉曼散射效应,在与贵金属纳米颗粒接触后,聚集产生强烈的电磁场增强,形成局域表面等离子体共振,形成“热点”效应.目前,有两种被广泛接受的增强机制:电磁场增强(EM)和化学增强(CM).EM是由J e a n
12、 m a i r e和V a nD u y n e首次提出的,主要是基于局域表面等 离子体共 振(L S P R)引 起 的 电 场 增强.由A l b r e c h t和C r e i g h t o n提出的CM是由于电荷转移(C T)效应,即吸附分子和金属衬底之间形成电荷转移络合物从而实现增强效应.当分子吸附在粗糙的贵金属(如金、银)纳米颗粒表面时,在两种增强机制的协同作用下,吸附分子的拉曼散射信号可以被强烈放大到 个数量级,甚至可以进行单分子的检测.因此,S E R S可在复杂环境中捕捉目标物的分子振动信号,提供有关分子的结构、化学成分甚至数量等信息.随着纳米材料和生物技术的进步,S
13、 E R S在细菌鉴定、环境监测、食品安全等领域的应用被广泛研究.因其高灵敏度、快速、无损检测、指纹图谱等优点,近年来,S E R S在细菌病原体检测方面的工作不断涌现.自从H o l t和C o t t o n首次报道细菌的S E R S谱以来,S E R S方法就因其在细菌检测中的特异性光谱指纹和无损的数据获取而一直激发着人们的研究兴趣.目前,细菌病原体的检测主要有两种策略:基于标记法(l a b e l b a s e d)和无标记法(l a b e l f r e e)(如图所示).基于标记的S E R S方法被认为是一种间接的方法,在基于标记的细菌检测中,超灵敏的拉曼信号来自S E
14、R S标签的拉曼报告(R a m a nr e p o r t e r)分子,组装的S E R S标签还可以通过特定的识别单元与细菌结合,从而能够通过检测报告分子的拉曼信号来间接检测细菌.基于标记的S E R S方法检测灵敏度高、重现性好,可以用不同的拉曼报告分子实现多菌种检测.与标记法相比,无标记的S E R S方法是一种直接的方法.无标记方法基于固有的振动指纹直接检测细菌细胞或细菌代谢物的原始拉曼信号,这种方法常用于病原体识别,通过使用统计算法处理数据来分析拉曼光谱的差异.无标记检测法简单、易于实施,然而,细菌的原始拉曼信号很弱,加之受复杂介质中生物分子的结构、构象和取向的影响,这使得获得
15、高度重复性的光谱数据成为较大挑战,.随着两种策略在细菌病原体检测方面的不断探索,一些新兴的方法也被陆续开发.基 于 核 酸 适 配 体 开 发 的 适 体 传 感 器 用 于S E R S检测生物的方法,也被叫做均相S E R S传感器,是一种既可以通过适配体识别单元特异性识别细菌,又可以直接检测病原菌细胞原始拉曼信号的细菌均相检测技术.本文主要从用于细菌检测的S E R S基底类型、检测体系、病原菌检测应用等方面概述了近些年来利用标记和无标记的S E R S方法检测病原菌的进展和趋势.首先,从S E R S基底的类型入手,介绍了无标记S E R S基底和标记S E R S基底的组成及检测方法
16、,然后讨论了S E R S在病原菌检测和食品安全 检 测 方 面 的 最 新 进 展.此 外,还 介 绍 了S E R S与其他协同检测技术的结合应用.最后,对S E R S方法在病原菌检测中的应用进行了总结,并对其在实际应用中遇到的挑战提出了自己的看法.用于细菌检测的S E R S基底类型制备灵敏度高、重复性好、稳定性强的S E R S基底是实现细菌高灵敏检测的关键.S E R S可以通过无标记或标记的S E R S基底获得吸附在等离子体纳米材料表面的目标物或报告分子的指纹信息.无标记S E R S检测是采集目标病原菌原始分子指纹信息的光谱,可以同时分析样本中的多个目标.它具有相对简单、快速
17、、实时跟踪等优点,但是,在复杂介质中S E R S的信号往往会受到介质中的微环境、分子间相互作用和局部表面特性等因素的影响,因此直接从S E R S光谱中解析和鉴定样品中的目标病原菌有一定的难度.利用标签进行标记的S E R S方法可以解决这些问题,可以利用具有较大拉曼散射截面的分子作为拉曼报告分 子 对 等 离 子 体 纳 米 粒 子 的 表 面 进 行 修饰,这些具有明显拉曼特征峰的S E R S标签在经过涂层的保护和功能化后,具有特异性识别能光散射学报第 卷图基于标记和基于非标记的S E R S细菌检测方法示意图,(a)标记法由S E R S标签、S E R S基底、细菌组成;(b)由S
18、 E R S基底、细菌组成 F i g S c h e m a t i c i l l u s t r a t i o no f l a b e l b a s e da n d l a b e l f r e eb a s e dS E R Sm e t h o d f o rb a c t e r i ad e t e c t i o n,(a)t h e l a b e l b a s e d i s c o m p o s e do fS E R St a g s,S E R Ss u b s t r a t ea n db a c t e r i a;(b)t h e l a b e
19、 l f r e e i sc o m p o s e do fS E R Ss u b s t r a t ea n db a c t e r i a 力,可以用来指示目标病原菌的类型、存在状态和数量信息.然而,这些S E R S标签的制作具有耗时长、过程复杂和成本高等缺点.无标记的S E R S基底从传统的贵金属到半导体纳米材料或新型纳米复合材料,无标记S E R S基底由于其简单、灵敏和其他优点而受到广泛研究,在细菌检测领域具有广阔的应用前景.无标记S E R S检测是目标物直接与具有S E R S增强效应的贵金属纳米颗粒发生相互作用,拉曼信号直接来自目标物,为各种目标物的定性和定量检测
20、提供丰富的信息.它可以在不对S E R S基底和样品进行任何标记或特殊处理的情况下直接提供复杂基质中细菌标志物的内部S E R S信号.当目标物具有较大的拉曼截面时,可以使用无标记S E R S基底进行检测.在基底材料方面,无标记S E R S基底的材料大致可分为三类,即贵金属、无机非金属复合材料以及少量非贵金属.本节重点介绍基于贵金属、无机非金属复合材料的无标记S E R S基底.贵金属无标记S E R S基底贵金属纳米材料是最常用的S E R S基底,评价S E R S基底的性能一般有两个关键指标.一是能否显著增强了电磁场强度,可以通过调节贵金属纳米粒子的形貌和设计具有尖锐突起或小间隙的结
21、构来实现,如核壳结构、微针阵列、纳米星 等实现电磁场增强.第二,基底结构是否对靶分子有很强的吸附作用,可以通过对贵金属纳米材料进行一定的修饰做到提高吸附能力.L i a o等人 开发了一种基于硅纳米线(S iNW s)阵列的新型生物材料,将S E R S方法用于大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的捕获和传感检测.通过金属辅助化学蚀刻制备了垂直排列的S iNW s,并用均匀的A u A g核壳纳米颗粒(A uA gN P s)进行修饰.这些沉积的A u A gN P s与纳米线形成了多尺度拓扑结构,为细菌黏附提供了有效的附着位点.此外,A u A gN P s的A u核心增强了表面银原子的活性,并促进了A
22、 uA gN P s与细菌的结合.因此,经过A u A gN P s修饰的S iNW s(S iNW s A u A g)基底通过物理和化学增强效应,在 分钟内对饮用水中的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有高捕获和检测能力.W a n g等 研究开发了一种用于快速提取和S E R S检测大肠杆菌的等离子体微针阵列贴片(如图).通过在微模具中制备了亲水性微针矩阵,所得的微针贴片经臭氧处理并涂覆了高S E R S活性金纳米花.制备的等离子体微针阵列贴片能够在分钟内从琼脂模拟物中提取大肠杆菌,并能够进行高灵敏S E R S分析,其检测限为 c f u/g.M i g u e l等 开发并验证了一种基于银纳
23、米星的S E R S方法,用于区分临床相关的鲍曼不动杆菌和肺炎克雷伯氏菌.通过将细菌菌落与银纳米星混合,然后沉积在滤纸上进行S E R S光谱采集来表征分离株.光谱数据经过无监督和监督的多元数据分析方法处理,包括主成分分析(P C A)和偏最小二乘判别分析(P L S D A),第期孟治材:表面增强拉曼光谱方法在细菌检测中的研究进展能够进行鲍曼不动杆菌和肺炎克雷伯氏菌的区分.对于增强基底结构与靶分子之间的吸附作用,可以通过万古霉素(V a n)来实现.万古霉素是一种抗生素,可以将羰基和胺基之间的氢键与细菌细胞壁上的肽聚糖紧密结合.V a n的存在可以拉近细菌细胞壁与基底纳米颗粒之间的热点区域,
24、使得S E R S信号获得大而稳定的增强.S i v a n e s a n等 通过简单的恒电位电沉积,在经过电化学粗糙处理的纳米银基底上沉积了一层薄的金层,从而制备了银金(A g A u)双金属S E R S基底.所得到的基底非常稳定,并展现出强烈的拉曼增强效应,之后将V a n涂层覆盖在A g A u基底上,可以选择性的捕获并检测血样中的细菌.能够检测的细菌包括大肠杆菌、沙门氏菌、表皮葡萄球菌和巨大芽孢杆菌,它们的S E R S光谱与对照组相比具有高度的可重复性.这些贵金属纳米材料作为S E R S基底应用在细菌检测领域,促进了S E R S方法在细菌检测方面的实际应用.图基于微针(MN)
25、的表面增强拉曼光谱检测食品中的细菌,(a)制备具有S E R S活性的MN贴片;(b)选择性捕获和表面增强拉曼散射检测MN贴片上的细菌 F i g MN b a s e dS E R Sd e t e c t i o no f b a c t e r i a i n f o o d s a m p l e s(a)P r e p a r a t i o no f t h eS E R S a c t i v eMNp a t c h(b)S e l e c t i v e c a p t u r ea n dS E R Sd e t e c t i o no fb a c t e r i ao
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