YAP-shRNA载体构建及其对食管鳞癌细胞系生物学行为的影响.pdf
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1、 载体构建及其对食管鳞癌细胞系生物学行为的影响韩高扬,李小丽,王瑞娟,韩玉杰,张仁锋,魏创业,孔晓煌,连欢欢,王金龙(郑州大学附属郑州中心医院 胸外科,河南 郑州 ;郑州大学第一附属医院 肿瘤科,河南 郑州 )基金项目:河南省医学科技攻关计划(联合共建)基金资助项目()通信作者:王金龙:摘要:目的评价 相关蛋白()在食管鳞癌()中的表达及其临床意义,并研究 对食管癌细胞系生物学行为的影响。方法运用免疫组化检测 在食管鳞癌组织和正常组织中的表达情况。设计 质粒并转染食管癌细胞系(和 ),运用 和蛋白质印迹检测细胞系中 的表达情况。小室和 检测转染前后细胞系的侵袭和增殖能力。结果 在食管鳞癌组织中
2、高表达,且食管鳞癌 阳性的患者生存期明显缩短。和蛋白质印迹显示细胞转染成功且可挑选出转染效率最优的质粒。小室和 检测到转染后的细胞系的侵袭和增殖能力下降。结论食管癌组织中 高表达,且 阳性的患者生存期明显缩短,抑制 表达将减弱食管癌细胞系的侵袭和增殖能力。关键词:食管癌;相关蛋白;转染;生存期中图分类号:,(,;,):()(),(),:;食管癌(,)是造成死亡的第六大癌症 ,全球总发病率的 左右发生在发展中国家,中国占全球 病例的 以上,每年约 万例 。尽管手术切除、辅助放化疗和免疫治疗等措施有所进展,但食管鳞癌(,)的 生存率仍然很低 。传统的治疗方法还远远不能令人满意。与大多数其他癌症一样
3、,的发展是复杂的,其发生机制尚未完全阐明。信号传导通路最初是以果蝇 样激酶 而命名的通路。通路主要的生物学效应包括控制细胞的分化、调节细胞增殖凋亡平衡、维持细胞的接触性抑制及参与肿瘤的发生 。信号通路故障,动态平衡被破坏,会导致细胞增殖异常,甚至肿瘤的发生 。在 信号传导通路中寻找新靶点,在分子水平、细胞水平、动物实验和临床试验等方面研究治疗恶性肿瘤的方法,已成为现在研究 信号传导通路的主要方向。其中 相关蛋白(,)是 信号传导通路下游的河南医学研究 年 月第 卷第 期 ,关键效应分子,在人体内,通路参与细胞增殖的负调控,磷酸化后是抑制转录的关键因子,但有些研究表明 是一个癌基因,可促使正常细
4、胞向恶性肿瘤细胞分化。因此本实验通过研究 在 中的表达情况,并构建 来了解其对食管鳞癌细胞系生物学行为的影响,以期找到食管癌治疗的新靶点。对象与方法 研究对象选取 年 月至 年 月在郑州大学第一附属医院胸外科接受食管癌根治术且病史资料完整的 例食管鳞癌组织标本,同时取正常食管组织(距恶性肿瘤 )。患者术前无放疗、化疗和免疫治疗史,所有患者均自确诊之日起进行随访,直至 年月 日或患者死亡,其中 例患者随访失联,此项研究得到了郑州大学第一附属医院医学伦理委员会的支持。按 年国际抗癌联盟最新的食管癌 分期(第 版)进行分期 。由 名不知此研究内容的病理科医生共同判定病理切片免疫组化评分。免疫组化结果
5、判定采用半定量法,结合染色强度和染色范围评判 表达结果。根据病理切片染色的强度和染色阳性细胞占总细胞的比率进行评分。染色强度:阴性(强度和阴性对照类似)为 分;弱阳性(淡黄色)为分;阳性(黄色)为分;强阳性(棕黄色)为分。染色阳性细胞占比:阳性细胞数 为 分,为 分,为 分,为 分,为 分。结合染色强度与染色阳性细胞占比的乘积进行综合判定:分为阴性(),分为弱阳性(),分为阳性(),分为强阳性()。细胞培养人食管鳞状细胞系 和 (购自中国科学院上海细胞库)在含有 (体积分数)胎牛血清的 (,)中培养。培养温度为 ,二氧化碳体积分数为 。细胞在转染前 接种在六孔板中。质粒与转染针对不同的靶序列(
6、表 ),设计了 种用于 敲除的 质粒:()、()、()、()和 ()的阴性对照质粒。使用 转染试剂(德国希尔登 )将质粒转染到相应细胞中。后采用 检测各组 表达情况,后采用蛋白质印迹检测各组 蛋白表达情况,以评估 种质粒的有效性,从而为后续实验选择最佳质粒。表 种不同的靶序列质粒名称靶序列 检测 后利用 (,加利福尼亚州卡斯巴德)试剂从细胞中提取 。按逆转录试剂盒说明书(美国赛默飞世尔科学公司)对每个 样本()进行逆转录合成 合成。然后利用 检测 基因表达量。以管家基因 作为内参,引物序列和 引物序列如(表 )所示。每组设 个复孔,以 作为参照,计算 均值,应用相对定量法 进行定量分析。表 引
7、物序列和 引物序列靶基因上游引物下游引物 蛋白质印迹检测各组 蛋白表达情况 后提取蛋白,采用紫外分光光度计测提取蛋白的水平,配制分离胶,水封,加浓缩胶,跑胶,电泳转膜,封闭,加入一抗(),在 冰箱内过夜孵育,用 液 洗 膜 遍,然 后 再 加 入 稀 释 的 二 抗()进行孵育,用 液洗涤 遍,最后加荧光显影剂显影。小室检测侵袭能力用 和 转染 和 细胞系,并进行培养。后先用胰蛋白酶分离细胞,再用 洗涤,培养在无血清培养液中。在下室中加入 的含血清的培养液,稀释肿瘤细胞悬液至每毫升 个,并吸取 细胞悬液加入上室中。在 、的培养箱中培养 。用棉签擦去滤膜上方未穿出的肿瘤细胞,滤膜用 多聚甲醛固定
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