miR-101对乳腺癌患者的诊断及对乳腺癌细胞自噬和凋亡的影响.pdf
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1、10 Verma A,Singh A,Singh MP,et al.EZH2-H3K27me3 me-diated KRT14 upregulation promotes TNBC peritoneal me-tastasisJ.Nat Commun,2022,13(1):7344.11 郭 红 艳,徐 亚 茹,李 耕 慧,等.长 链 非 编 码 RNA Linc00673 过表达对胃癌 MGC-803 细胞增殖与凋亡的影响J.中国应用生理学杂志,2022,38(1):53-58.12 Xue P,Huang S,Han X,et al.Exosomal miR-101-3p and miR-
2、423-5p inhibit medulloblastoma tumorigenesis through targeting FOXP4 and EZH2J.Cell Death Differ,2022,29(1):82-95.13 Zhang Y,Li R,Ding X,et al.Long noncoding RNA SNHG6 promotes oesophageal squamous cell carcinoma by downreg-ulating the miR-101-3p/EZH2 pathwayJ.Biochem Mol Toxicol,2022,36(2):22959.【文
3、章编号】1006-6233(2023)08-1240-06miR-101 对乳腺癌患者的诊断及对乳腺癌细胞自噬和凋亡的影响宋雅琪,张志生,孔令霞,刘进宇(河北北方学院附属第一医院乳腺外科,河北张家口 075000)【摘要】目的:探讨血清 miR-101 在乳腺癌患者中的表达和临床特征,以及对 MCF-7 细胞自噬和凋亡的影响。方法:选择 2021 年 6 月至 2022 年 10 月收治的 96 名乳腺癌患者作为观察组,41 例乳腺良性增生患者作为良性组,35 名健康体检者作为正常对照组。qRT-PCR 检测 3 组血清 miR-101 的表达水平;比较乳腺癌患者不同临床病理特征血清 miRN
4、A-101 表达水平;ROC 曲线分析 miR-101 的诊断价值。应用 miR-101 mimic 试剂对乳腺癌细胞株(MCF-7)进行转染,qPCR 法检测 MCF-7 和正常乳腺细胞株(HBL-100)miR-101 的表达;CCK-8 法检测各组细胞的增殖;qPCR 法和 Western blot 法检测细胞自噬和凋亡基因和蛋白的表达;流式细胞术检测各组凋亡率。结果:观察组 miRNA-145 相对表达量(n=96,0.27)显著低于良性组(n=41,0.63)和对照组(n=35,1.00),差异有统计学意义(P0.01)。血清 miRNA-101 的表达在淋巴结转移、分化程度、肿瘤直
5、径和 TNM 分期差异具有显著性(P 0.01)。ROC 曲线分析显示,在 3 组对比中,曲线下面积分别为 0.723(95%CI:0.813-0.924)和 0.875(95%CI:0.8350.981)。CCK-8、qPCR 和 Western blot 结果显示,miR-101 过表达可抑制 MCF-7 细胞增殖,显著增加 MCF-7 细胞 BAX 的基因和蛋白表达(P0.01),降低 BCL-2、LC3B 和 Beclin-1 基因和蛋白的表达(P0.01),增加 MCF-7 细胞凋亡率。结论:在乳腺癌患者中,血清 miR-101 的表达水平显著降低,可能成为潜在的乳腺癌的诊断指标。此
6、外,miR-101 过表达具有抑制 MCF-7 乳腺癌细胞增殖、抑制自噬,并促进细胞凋亡的作用。这些结果为进一步研究 miR-101 在乳腺癌发生和发展中的机制提供了重要线索,为乳腺癌的早期诊断和治疗提供了新的策略。【关键词】乳腺癌;自噬;凋亡【文献标识码】A 【doi】10.3969/j.issn.1006-6233.2023.08.02The Effect of miR-101 on the Diagnosis of Breast Cancer Patients and Autophagy and Apoptosis of Breast Cancer CellsSONG Yaqi,ZHAN
7、G Zhisheng,KONG Lingxia,et al(The First Affiliated Hospital of Hebei North University,Hebei Zhangjiakou 075000,China)【Abstract】Objective:To investigate the expression and clinical characteristics of serum miR-101 in patients with breast cancer and its effects on autophagy and apoptosis of MCF-7 cell
8、s.Methods:A total of 96 patients with breast cancer treated from June 2021 to October 2022 were selected as the observation group,41 patients with benign breast hyperplasia were selected as the benign group,and 35 healthy subjects were select-ed as the normal control group.The expression level of mi
9、R-101 in serum of the 3 groups was detected by 0421 第 29 卷 第 8 期2023 年 8 月 河 北 医 学HEBEI MEDICINE Vol.29,No.8Aug.,2023 【基金项目】河北省医学科学研究课题,(编号:20231418)【通讯作者】张志生qRT-PCR.The expression levels of serum miRNA-101 in different clinicopathological features of breast canc-er patients were compared.The diagno
10、stic value of miR-101 was analyzed by ROC curve.Breast cancer cell line(MCF-7)was transfected with miR-101 mimic reagent.The expression of miR-101 in MCF-7 and nor-mal breast cell line(HBL-100)was detected by qPCR.The cell proliferation was detected by CCK-8 meth-od.The expressions of autophagy and
11、apoptosis genes and proteins were detected by qPCR and Western blot.The apoptosis rate of each group was detected by flow cytometry.Results:The relative expression of miRNA-145 in observation group(n=96,0.27)was significantly lower than that in benign group(n=41,0.63)and control group(n=35,1.00),the
12、 difference was statistically significant(P0.01).The expression of serum miRNA-101 was significantly different in lymph node metastasis,differentiation degree,tumor diameter and TNM stage(P0.01).ROC curve analysis showed that the area under the curve was 0.723(95%CI:0.813-0.924)and 0.875(95%CI:0.835
13、-0.981)in the three groups of comparison,respectively.The results of CCK-8,qPCR and Western blot showed that over-expression of miR-101 inhibited the proliferation of MCF-7 cells,significantly increased the gene and protein expression of BAX in MCF-7 cells(P0.01),and de-creased the gene and protein
14、expression of BCL-2,LC3B and Beclin-1 in McF-7 cells(P0.05)。纳入标准:全部患者均签署了知情同意书;所有观察组乳腺癌患者经组织病理学诊断;全部病例为首次确诊,未接受过手术、放化疗和生物学治疗,未合并其它原位肿瘤;良性组均经彩超或组织病理学证实;正常对照组无乳腺相关疾病。排除标准:妊娠及哺乳妇女;自身免疫疾病;临床资料不完整的研究对象。1.2 实验材料:清晨收集 3 组外周静脉血中抽取 5mL到试管中,在 4 离心机中进行离心,提取上层血清,将血清放入无 RNA 酶的 EP 管中,EP 管放入-80的冰箱中进行保存。乳腺癌细胞株 MCF-
15、7 及正常乳腺细胞株 HBL-100,购自上海生命科学院细胞和生物化学研究所。1640 培养基和青链霉素购于美国 Sigma公司;胎牛血清购于 GIBCO 公司;Trizol 购于中国上海翌圣生物有限公司;miR-101 mimics、mimics control 购自上海吉玛制药公司;Annexin V-FITC/PI 凋亡试剂盒购于江苏凯基生物公司;CCK-8 试剂盒购于日本同1421 第 29 卷 第 8 期2023 年 8 月 河 北 医 学HEBEI MEDICINE Vol.29,No.8Aug.,2023 仁化学研究所;2RealStar Fast SYBR qPCR Mix 和
16、反转录试剂盒购于北京康润公司;BAX、BCL-2、LC3B、Beclin-1 一抗兔抗购于美国 Sigma 公司。1.3 方 法1.3.1 细胞培养及分组:快速解冻 MCF-和 HBL-100细胞,离心去除上清,然后在含有 1%青霉素/链霉素/庆大霉素的 90%培养基和 10%血清中重悬。将细胞以 1105 cells/mL 的浓度接种于 25cm2的烧瓶中,在37、5%CO2的培养箱中培养至细胞融合度达到 80%。用 0.25%胰蛋白酶-edta 传代,1500rpm 离心;每 2 天更换一次培养基。细胞分组为空白对照组,miR-101 空载组(阴性对照组),miR-101 转染组。1.3.
17、2 荧光定量(qRT-PCR):总 RNA 用 Trizol 提取,将提取的 RNA 提取物反转录为 cDNA。进行实时定量 PCR。用于实时定量 PCR 的具体 miR-101 引物序列如下:R-5-TACAGTACTGTGATAACTGAA-3,F-5-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3。引物由上海生工生物有限公司合成。使用 2-Ct方法测量 miRNA-101 相对于 U6 的表达。U6 引物序列如下:R-5-CGCTTCG-GCAGCACATATAC-3,F-5-TTCACGAATTTGCGT-GTCAT-3。1.3.3CCK-8 检测细胞增殖:根据使用说明,使用CCK-8 试剂
18、测定细胞增殖,将细胞以 5104个细胞/孔接种到 96 孔板中。在 24h、48h、72h 和 96h 后,用CCK-8 试剂处理细胞并孵育 2h。使用 Bio-Rad 酶标仪(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)在 450nm 波长下测量吸光度。1.3.4miR-has-miRNA-145 表达载体构建及转染:将 MCF-7 和 HBL-100 细胞接种在 6 孔板中,根据制造商提供的说明,使用 Lipofectamine 2000 转染试剂将miR-101mimics 和 miR-101minics control 转染到细胞中,培养 48h 后,收集细胞用于分析。1.3.5流
19、式细胞术检测细胞凋亡:使用 Annexin-V-FITC/PI 凋亡检测试剂盒检测凋亡细胞。获取处理后的 1105细胞,在避光下用 Annexin-V-FITC/PI 孵育5min 用 FACSCalibur 流式细胞仪分析凋亡细胞。1.3.6 蛋白质免疫印迹(Western Blot):使用 RIPA 裂解液提取总蛋白。BCA 测定蛋白浓度,进行凝胶电泳,凝胶随后转移到 PVDF 膜上,一抗 4 过夜,二抗孵育 2h。采用 ECL 测量信号。1.3.7 数据分析:所有数据分析均使用 SPSS24.0 软件。数据采用(xs)表示,使用单因素方差分析,LSD检验确认各组数据之间的差异性,计数资料
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