地衣芽孢杆菌发酵雪茄烟叶对香气成分生成的影响.pdf
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1、第 7 期收稿日期:2021-12-27基金项目:中国烟草总公司科技重大专项项目(110202001039(XJ-01);湖北省烟草公司项目(027Y2020-005)作者简介:胡路路(1994-),男,江苏宿迁人,硕士,主要从事中式雪茄原料开发,(电话)15665166214(电子信箱);通信作者,陈雄(1969-),男,湖北武汉人,二级教授,博士研究生导师,博士,主要从事食品生物技术(发酵食品工艺改造与品质提升、农副产品生物转化及资源开发)研究,(电话)13308639592(电子信箱)cx163_。第 62 卷第 7 期2023 年 7 月湖北农业科学Hubei Agricultural
2、 SciencesVol.62 No.7Jul.,2023胡路路,宋雯,余君,等.地衣芽孢杆菌发酵雪茄烟叶对香气成分生成的影响 J.湖北农业科学,2023,62(7):107-112在适宜温度和湿度条件下,雪茄烟叶发酵过程中大分子物质分解形成小分子香气物质1,如类胡萝卜素降解产物法尼基丙酮、大马士酮、巨豆三烯酮等;叶绿素降解产物新植二烯;苯丙氨酸转化产物苯甲醇、苯乙醇、苯乙醛2;棕色化反应产物糠醛、糠醇等物质3,从而产生雪茄烟特有的品质和风味4。微生物的生长代谢贯穿于雪茄烟叶发酵过程,添加特定微生物可提高烟叶品质5,如李宁等6筛地衣芽孢杆菌发酵雪茄烟叶对香气成分生成的影响胡路路1,宋雯1,余君
3、2,杨春雷2,王志1,陈雄1(1.湖北工业大学/教育部工业发酵省部共建协同创新中心/发酵工程教育部重点实验室/湖北省工业微生物重点实验室,武汉430068;2.湖北省烟草科学研究院,武汉430030)摘要:以雪茄CX-014烟叶为原料,研究了营养剂和接种地衣芽孢杆菌对雪茄香气生成效率和烟叶品质的影响。结果表明,正交优化得到营养剂配方为3.0%葡萄糖、0.6%谷氨酸、0.6%磷酸氢二铵。添加营养剂(试验组)发酵7 d的香气物质总含量达到635.2 g/g,较自然发酵提高了16.4%;类胡萝卜素转化产物、苯丙氨酸转化产物、棕色化反应产物分别较自然发酵提高了38.2%、159.6%和75.9%。基于
4、试验组接种地衣芽孢杆菌(2108CFU/g,优化组)发酵7 d,与试验组相比,其香气物质总含量为791.6 g/g,提高了24.6%;类胡萝卜素转化产物含量为63.3 g/g,提高了45.9%;棕色化反应产物含量为25.2 g/g,提高了27.9%。关键词:雪茄烟叶;地衣芽孢杆菌;正交优化;营养剂;香气成分中图分类号:TS453文献标识码:A文章编号:0439-8114(2023)07-0107-06DOI:10.14088/ki.issn0439-8114.2023.07.019开放科学(资源服务)标识码(OSID):Effects of cigar leaves fermentation
5、by Bacillus licheniformis on aroma components formationHU Lu-lu1,SONG Wen1,YU Jun2,YANG Chun-lei2,WANG Zhi1,CHEN Xiong1(1.Hubei Provincial Cooperative Innovation Center of Industrial Fermentation(Ministry of Education&Hubei Province)/Key Laboratory ofFermentation Engineering(Ministry of Education)/H
6、ubei Key Laboratory of Industrial Microbiology,Hubei University of Technology,Wuhan 430068,China;2.Hubei Tobacco Research Institute,Wuhan 430030,China)Abstract:CX-014 cigar leaves as raw materials were used to study the effects of nutrients and Bacillus licheniformis on the aroma components producti
7、on efficiency and the quality of cigar leaves.The results showed that the nutrient formula obtained by orthogonal optimization experiments was 3.0%glucose,0.6%glutamate and 0.6%diammonium phosphate.The total content of aroma substances fermented by 7 d with added nutrient(test group)reached 635.2 g/
8、g,which was 16.4%higher than that of the natural fermentation.Thecarotenoid transformation products,phenylalanine transformation products and brown reaction products increased by 38.2%,159.6%and 75.9%compared with natural fermentation,respectively.Then,the test group inoculated with Bacillus licheni
9、formis(2108CFU/g,optimized group)had been fermented for 7 days.Compared with the test group,the total content of aroma substances was 791.6 g/g,which was increased by 24.6%;the content of carotenoid transformation products(63.3 g/g)and the brown reaction products(25.2 g/g)was increased by 45.9%and 2
10、7.9%,respectively.Key words:cigar leaves;Bacillus licheniformis;orthogonal optimization;nutrient;aroma components湖北农业科学2023 年选添加蜡样芽孢杆菌降低了烟叶含氮化合物含量,减少了刺激性;胡希7添加短小芽孢杆菌降低了雪茄烟叶中的青杂气,香气更加醇厚饱满;郑小嘎等8利用真菌制作成菌剂处理烟丝提高了香气浓度和香气质量。杨培香等9将枯草芽孢杆菌添加到烟丝中,提高了烟叶的糖氮比,抽吸口感更加细腻。晾晒期雪茄烟叶内营养物质(如碳水化合物、蛋白质等)开始转化10,但晾晒后烟叶存在酸碱不平
11、衡等问题,使雪茄吃味辛辣、口感苦涩11。另外,其糖氮比低也不利于微生物的生长代谢12。而添加适宜的营养剂可以改善这一矛盾,如加入猕猴桃添加剂,可以提高雪茄吃味品质、丰富香气13;添加牛奶浸提液提高了类胡萝卜素转化效率14;喷洒水溶冬青胶加强了雪茄烟叶木香特征15;添加菊花浸提液提高了中性香气物质含量,余味醇净、甜感改善16。由于雪茄烟叶发酵过程成分转化存在复杂性和不确定性,而添加不同来源的营养物(呈香有机物质提取液等)成分复杂,何种成分最优未知,因而难以保障烟叶发酵品质的稳定性。作为雪茄烟叶表面优势菌群,地衣芽孢杆菌能够产生多种活性酶,如蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶等。本研究以恩施 CX-014
12、雪茄烟叶为原料,通过正交优化得到成分简单、明确的营养剂配方,并接种地衣芽孢杆菌进行发酵,显著提高了蛋白质降解产物参与的棕色化反应效率,促进了雪茄烟叶致香成分或小分子香气物质的转化,为中式雪茄烟叶特色发酵提供技术支撑。1材料与方法1.1材料与仪器材料:地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)由实验室保藏(从恩施烟叶表面筛选菌株);CX-014雪茄烟叶为湖北省烟草科学研究院提供;葡萄糖、谷氨酸、磷酸氢二铵、氯化钠、二氯甲烷,国药集团上海有限公司。LB 培养基:胰蛋白胨 10 g/L,NaCl 10 g/L,酵母粉5 g/L,121 灭菌20 min。仪器:HNHWS-11-25
13、0 型恒温恒湿培养箱,天津欧诺仪器股份有限公司;DF-101S型集热式恒温加热磁力搅拌器,巩义市予华仪器有限责任公司;7890GC-5973MS型气相色谱-质谱联用仪,美国Agilent公司。1.2试验方法1.2.1正交试验设计以葡萄糖、谷氨酸、磷酸氢二铵添加量为优化因素,以雪茄烟叶发酵后挥发性香气物质及棕色化反应产物含量为指标,采用三因素四水平正交设计(表1),确定最佳发酵营养剂组合。表1正交试验因素水平水平1234因素葡萄糖添加量(A)/%0.51.02.03.0谷氨酸添加量(B)/%0.60.81.01.2磷酸氢二铵添加量(C)/%0.30.40.50.61.2.2雪茄烟叶发酵方法参考覃
14、明娟等17的方法,将晾制完毕的雪茄烟叶回潮至适当水分后切丝,按照正交试验设计的组别,将不同浓度组合的营养物质加入无菌水充分溶解制成营养液,并均匀喷洒在烟丝上,等到水分平衡后放入恒温恒湿培养箱中,37、80%RH发酵14 d。1.2.3雪茄烟叶的地衣芽孢杆菌发酵地衣芽孢杆菌液体扩大培养,培养至对数生长后期,将培养物经过离心、清洗等步骤获得菌体。将菌体与正交最优配方组合混合,加入适量无菌水充分溶解制成接种液,将接种液均匀喷洒在烟丝上,等到水分平衡后放入恒温恒湿培养箱中,37、80%RH 进行发酵,5、7、9、11、14 d 取样,接种量 2108CFU/g。同时考察基础组接种等量地衣芽孢杆菌对烟叶
15、醇化的影响。1.2.4样品处理将发酵结束后的烟丝烘干,用粉碎机粉碎后过40目筛,过筛后的样品4 密封保存。1.2.5烟叶中挥发性香气成分提取与测定称取10 g磨碎后的烟末置于 1 000 mL圆底烧瓶中,加入饱和食盐水 200 mL,同时将 60 mL 二氯甲烷置于100 mL 圆底烧瓶中,分别连接在 SDE 装置左右两侧。有机相(二氯甲烷)使用55 水浴加热,水相使用160 油浴加热。待同时蒸馏萃取装置达到液液分层后,继续反应 5 h,收集萃取液。使用旋转蒸发仪将萃取液浓缩至2 mL,加入1.202 8 mg/mL乙酸苯乙酯(50 L)作为内标。加入无水硫酸钠干燥后,使用0.22 m微孔有机
16、滤膜过滤后放入Agilent进样瓶备用。内标溶液的配制。准确称取乙酸苯乙酯内标0.300 7 g于 250 mL 容量瓶中,使用二氯甲烷定容,4 冷藏备用。GC 条件。色谱柱:HP-5MS 毛细管柱(30 m0.25 mm0.25 m);升温程序:40 保持 2 min,以2/min升至200,保持5 min,然后10/min升至280;载气(He)流速:1 mL/min;进样量:1 L;分流比:10 1。质谱条件。电子轰击离子源;电子能量 70 eV;传输线温度:250;离子源温度:230;质量扫描范围:35550 m/z。108第 7 期1.3数据处理试验数据为 3 组平行试验均值,采用
17、SPSS 26和 Excel软件进行数据分析,并用 Origin 2019b软件绘图。2结果与分析2.1正交试验结果及分析为提升烟叶香气整体含量,研究基于雪茄烟叶营养成分特征发酵对特定香气产物的影响,按照L16(43)的设计完成正交试验,记录每个组合发酵14 d萃取后的棕色化反应产物含量及总致香物质含量,结果见表 2。总香气物质总含量方差分析不显著,棕色化反应产物方差分析结果见表3。表2L16(43)正交试验设计及试验结果序号12345678910111213141516D k1D k2D k3D k4R最优水平E k1E k2E k3E k4R最优水平A1111222233334444207
18、.53318.78258.00345.48137.95A40.792.031.703.342.55A4B1234123412341234316.08272.50238.28302.9377.80B12.352.450.842.231.61B2C1234214334124321196.13267.70296.58369.40173.27C41.030.162.843.853.69C4香气物质总含量(D)/g/g127.9171.8119.7410.7349.8248.3335.2341.8335.3280.4182.7233.6451.3389.5315.5225.6棕色化反应产物(E)/g/g
19、0.10.2ND2.90.11.53.13.43.13.40.10.26.14.80.12.4注:将每一因素4个水平的4次试验指标之和的平均值记为k;R=kmax-kmin;ND表示未检测出由表2可知,试验浓度范围内,影响棕色化反应产物与香气物质总含量的3个因素主次顺序均为磷酸氢二铵添加量、葡萄糖添加量、谷氨酸添加量,综合考虑棕色化反应产物与香气物质总含量以及添加营养物质的成本因素,选取营养剂最优组合为A4B1C4(葡 萄 糖 3.0%、谷 氨 酸 0.6%,磷 酸 氢 二 铵0.6%),这也验证了烟叶营养成分种类及含量对雪茄发酵香气生成有着重要影响这一论述18。由表3可知,磷酸氢二铵添加量与
20、葡萄糖添加量对棕色化反应产物具有极显著影响,而谷氨酸添加量对棕色化反应产物具有显著影响。正交试验同时平行进行了自然发酵对照试验,烟叶自然发酵与最优组合(正交表 13号)发酵 14 d后主要4类香气成分及含量如表4所示。表4最优组合与自然发酵样中香气物质含量(单位:g/g)香气物质棕色化反应产物苯丙氨酸转化产物类胡萝卜素转化产物西柏烷类降解产物植物醇新植二烯香气总含量自然发酵0.32.224.111.452.5169.9288.9正交最优6.86.932.819.760.4270.1451.1最优组合(正交表 13号)发酵 14 d香气物质总含量为451.1 g/g,较自然发酵提高了56.1%。
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