LncRNA NNT-AS1通过miR-582-5p_MCL1对肝癌细胞侵袭和转移的影响.pdf
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1、基础研究 通过 对肝癌细胞侵袭和转移的影响孙波,周雷,周东亚,王小龙,徐超,吕莹,刘?(南京中医药大学沭阳附属医院 肿瘤科,江苏 宿迁 )摘要目的探讨 通过 轴对肝癌的侵袭和转移的影响。方法培养正常肝 细胞和肝癌细胞 、,选取肝癌 细胞系,将细胞进行分组与转染;采用 检测各组细胞中 、表达,检测各组细胞 蛋白表达,检测 和 的结合情况,双荧光素酶报告基因实验验证 和 靶向关系,实验检测细胞侵袭和转移能力。结果与正常肝细胞 比较,在肝癌细胞系中高表达,在肝癌细胞系中低表达;和 沉默后,细胞中 和 表达显著降低,细胞侵袭和转移能力也明显减弱;可结合吸附 ,是 的下游靶基因、且 在肝癌细胞系中高表达
2、;干扰 或过表达 表达可抑制肝癌细胞侵袭和迁移;同时沉默 和过表达 ,可显著降低细胞侵袭和迁移能力;干扰 也可抑制肝癌细胞侵袭和迁移能力增强的现象。结论沉默 可通过 作用,抑制 表达从而抑制肝癌细胞侵袭和转移。关键词 反义核糖核酸 ;微小核糖核酸 ;髓细胞白血病 ;肝肿瘤;侵袭;转移 中图分类号 文献标识码 文章编号 ():,(,),第 卷第 期 年 月贵 州 医 科 大 学 学 报 基金项目 国家中医药管理局重点研究室开放课题();宿迁市科技计划项目()引用本文:孙波,周雷,周东亚,等 通过 对肝癌细胞侵袭和转移的影响 贵州医科大学学报,():,;肝癌是全球最常见的癌症死亡原因之一,也是中国
3、第 大最常见的癌症死亡原因 。肝癌的预后很差,即使经过手术切除和标准化治疗,其复发率和转移率仍然很高 。因此,深入研究肝癌防治的新靶点,对提高肝癌的早期诊断和临床预后具有重要意义。长非编码 ()是一类非蛋白质编码 转录物,长度超过 个核苷酸,被认为是癌症生物学中的新型调控因子 。异常表达的 通过转录或转录后基因调控影响癌细胞的增殖、转移、自我更新和凋亡,促进多种癌症类型的发生发展 。有证据表明 可能是癌症检测的有效生物标志物,包括肝癌在内的多种癌症类型的致瘤性都涉及各种 。其中,是一种新鉴定的 ,位于 个外显子的 处,被认为是肝癌致癌基因 。在肝癌发展中的机制研究极为匮乏。通过降低其靶 的水平
4、在人类肿瘤中发挥作用已被广泛接受。据报道,通过抑制 增强肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭 。此外,牛磺酸上调基因 通过海绵 促进肝癌进展 。有研究表明,在肝癌中表达降低 ,是否通过调控 来影响肝癌进展仍不明确。是抗凋亡 家族蛋白的关键成员,的独特之处在于其有效的泛素化和破坏作用,并且具有促进肿瘤侵袭和转移的功能 。目前 在肝癌进展中的作用机制还不明确,是否由 介导和调节也不清楚。因此本研究旨在探讨 、和 对肝癌细胞侵袭和转移的影响。材料与方法 细胞培养选择正常肝细胞 细胞和肝癌细胞 、(购 于 ,中国)进行培养。置于 、细胞培养箱(型号 ,美国)中,用含 胎牛血清(,美国)的 培养基(,美国)培养,
5、每天更换培养基,传代。选择处于对数生长期并且生长状态较好的细胞进行实验。细胞分组及转染取对数期生长的人肝癌 细胞系 按 孔密度接种于 孔培养板内,转染前 用不含血清和双抗的 培养基培养将细胞分组并转染:组(不做处理细胞)、组、组、组、组、组、组、及 组,按照 说明书进行转染,将 、或 (上海吉玛公司,中国)快速离心,与 磷酸盐缓冲液(赛默飞世尔,)混匀后,静置 ,加入 (,美国),轻微震荡充分混匀后,室温下静置 ,添加后加入到 孔板中,轻轻混匀,换为含 胎牛血清的培养基(,美国)。转染 后,收集细胞用于后续实验。观察指标 检 测 、表达水平收集转染 后的各组细胞,(货号 ,赛默飞世尔科技,纽约
6、,美国;货号 ,哈尔滨新海基因检测有限公司,中国)提取总 。(公司,)逆转录合成 。试剂盒(行知生物科技有限公司,中国)进行荧光定量 检测。依次加入以下组分:(),上、下游引物各 ,(),模板 ,。在 (型号 ,上海坤科仪器设备有限公司,中国)系统进行荧光定量 。反应条件:预贵 州 医 科 大 学 学 报 卷变性 ,变性 ,退火 ,循环 次后 延伸 。(目的基因)(),(实验组)(对照组),基因以 为内参,用 表示各目的基因相对表达量。引物见表 。表 引物序列 名称方向序列 正向引物 反向引物 正向引物 反向引物 正向引物 反向引物 正向引物 反向引物 正向引物 反向引物 检测 蛋白表达细胞转
7、染培养 后,预冷的 洗 遍,使用含 的 裂解液(,)提取细胞中总蛋白。试剂盒(,美国)测定蛋白浓度,去离子水调零。样品与上样缓冲液混合,金属浴煮 ,点样时加入 蛋白样品,以 恒压电泳 。湿转法将蛋白转移至 膜(,)上,恒流 转膜。脱脂奶粉 室温封闭;弃去牛奶,洗去牛奶,用一抗兔抗人 (,)、(,)孵育过夜,洗 次,每次 。标记的羊抗兔 抗体(北京中山生物技术有限公司,稀释)孵育。洗 次、每次 ,洗后泡在 中。取 荧光检测试剂盒(货号 ,公司,英国)中 液和 液,等体积混匀,滴加在膜上,在凝胶成像仪中曝光成像。用 图象分析系统(美国 公司)照相,用 软件分析,以相应蛋白条带的灰度值 蛋白条带的灰
8、度值表示相对蛋白含量。检测 和 结合采用 试剂盒(,)检测 和 结合情况。用预冷 洗神经元后弃上清。用等体积的 裂解液(,碧云天)冰浴 裂解细胞,离心 取上清。细胞提取液一部分取出作为 ,一部分与抗体孵育进行共沉淀。具体步骤:每一个共沉淀反应体系取 磁珠清洗后重悬于 中,依据实验分组加入 抗体孵育以便结合。磁珠 抗体复合物经清洗后与重悬于 ,加入 细胞提取液 孵育过夜。样品置于磁座上收集磁珠 蛋白复合物。样品及 分别经蛋白酶 消化后提取 ,检测 和 结合。所用抗体为:(,),室 温 混 匀 ,(,)作为阴性对照。生物信息学网站和双荧光素酶报告基因实验首先经过生物学预测网站()进行 与 结合位点
9、的分析。接下来通过双荧光素酶报告系统验证 与 的靶向关系。构建靶基因 双荧光素酶报告基因载体与 结合位点突变的突变体:和 。将 质粒和两种报告质粒分别与 和 质粒共转染到 细胞中。将 质粒和两种报告质粒分别与 质粒和 质粒共转染到 细胞中,在细胞转染 后,进行双荧光素酶检测。首先将各组细胞裂解,裂解后以 离心 ,去沉淀,收集上清液。双荧光素酶报告试剂盒购自 ,按照试剂盒操作,测量荧光素酶活性。操作步骤如下:将裂解后的细胞样品吸入 管中,每 样品中萤火虫荧光素酶工作溶液 ,测得萤火虫荧光素酶之后加入海肾荧光素酶工作溶液 ,测得海肾荧光素酶结果。相对荧光素酶活性 萤火虫荧光素酶 海肾荧光素酶。检测
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