“不可培养”微生物的分离培养方法研究进展.pdf
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1、综述生命科学仪器 2023 第21卷/1期11“不可培养”微生物的分离培养方法研究进展赵俊天,张莹*(北京理工大学生命学院,北京,100081)Abstract:In recent years,with the development of microbiology,the exploration of microbial resources has been a topic of interest for researchers globally.This paper introduces the importance of obtaining pure culture of microor
2、ganisms in microbiological research,and the fact that most microorganisms in nature are still unable to be cultured in the laboratory.Based on this contradiction,this paper introduces in detail the new microbial culture methods and devices that have emerged in the past decade,their working and succe
3、ss.Finally,the existing microbial culture methods are compared,and some future prospects are presented in a quest to bring inspiration for the innovation and development of future microbial culture methods.This may result in a better exploration as well as utilization of different microbial resource
4、s.Key words:New method of microbial pure culture;Microbial germplasm resources;Uncultured microorganismsResearch progress in isolation and culture methods of non-culturable microorganisms ZHAO Juntian,ZHANG Ying*(School of Life Science,Beijing Institute of Technology,Beijing,100081)摘要:近年来随着微生物学的发展,微
5、生物资源挖掘成为热点问题。本文首先介绍了微生物纯培养在微生物学研究中的重要作用,以及自然界大多数微生物仍然无法在实验室中得到培养的现状;基于这一矛盾,详细介绍了近十年出现的新型微生物培养方法和装置并佐以实例;最后对现有微生物培养方法进行总结和展望,希望可以为未来微生物培养方法的创新和发展带来灵感,助力微生物资源的开发与利用。关键词:微生物纯培养新方法;微生物种质资源;不可培养微生物中图分类号:Q93 文献标识码:A DOI:10.11967/2023210202基金项目:国家自然科学基金项目(32270119)通讯作者:张莹(1986-),女,博士,北京理工大学,副教授,E-mail:作者简介
6、:赵俊天(1997-),女,硕士,E-mail:3120201425 综述生命科学仪器 2023 第21卷/1期120 引言微生物是地球上十分丰富的生物资源,人们利用微生物开发获得了许多衍生资源,如抗生素和酶类等1。然而,绝大多数微生物不能在实验室条件下生长2,已经实现实验室培养的微生物培养效率也并不高3,4。因此,提高微生物的培养效率、开发培养原本不可培养微生物的新方法对我们充分利用微生物资源有重要意义。1 微生物纯培养地球上的微生物种类丰富、数量庞大、分布广泛、繁殖迅速。作为自然界生态系统的重要组成部分,微生物不仅在生态平衡中起着举足轻重的作用,同时也是天然活性物质的重要来源。微生物产生的
7、多种次级代谢产物,具有从通信到防御的重要功能5-7,在人类健康8-10和环境的可持续发展方面也发挥着重要作用11,12。获得纯培养物是微生物学研究的基础,但传统的微生物培养方法越来越无法满足人类开发微生物资源的需求,因此需要探索更加高效的微生物培养方式。1.1 不可培养微生物地球上的微生物数量众多,据统计约有9.210293.21030个,微生物种的数量约为101213,但是目前能培养的微生物占自然界微生物总数不到3%,甚至更少14,表1列举了不同环境中微生物的可培养率15,可见,各种环境中微生物的可培养率普遍很低,绝大多数微生物都是不可培养的。表1 不同环境中微生物的可培养率Tab.1 Cu
8、lturability of microorganisms in different environments未培养微生物的概念起初是由Colwell等人在1982年提出16。1985年,Staley和Konopka发现在培养基上形成菌落的微生物细胞数量与在显微镜下观察到的数量相差甚远,并将这一现象称为“大平板计数异常”17。随后,1997年,Felske等人将能够通过分子生物学方法检测到,但未能在人工条件下获得纯培养的微生物定义为“至今未培养微生物”18。至此,越来越多的研究人员对这些尚未实现纯培养的不可培养微生物产生兴趣。1.2 获得微生物纯培养的意义和常用手段1881 年,Robert
9、Koch 建立了微生物纯培养的方法,通过平板划线的方法使微生物在培养过程中获得足够的生长优势,获得单菌落19。早在1891年,Kanthack 等人就利用平板划线纯培养方法实现了麻风分支杆菌(Mycobacteriumleprae)的纯培养20。液体稀释法(MPN法)也是常用的微生物培养方法,样品经高度稀释后培养,同一稀释度的多数试管样品中微生物不生长,微生物生长的试管很可能就是纯培养物21。除此之外,利用显微操作仪用毛细管或显微针、钩、环等在显微镜下分离获得单个微生物细胞后培养22也是获得纯培养物的重要方法。其中平板划线法从出现到现在依然是我们分离微生物最常用的重要手段,并且发挥着不可替代的
10、作用。研究微生物的形态结构、生理生化、调控机制和基因分析等重要内容都离不开微生物的纯培养23。在病原菌诊断、致病力模型建立和病原菌药物敏感性试验等方面也均需要纯培养物24。目前投入使用的抗生素,如青霉素、肉毒素等,都是以纯培养微生物为基础发现的。因此,获得微生物的纯培养为我们开发利用微生物资源奠定了基础。例如,2017 年,Girish 等人获得了温泉细菌 Paenibacillus polymyxa 的纯培养物并成功从中分离出了抗生素 Fusaridin B,该抗生素因其抗结核的特性而被赋予了新的价值和用途25。随着微生物纯培养技术的不断发展,微生物中所隐藏的生命奥秘,以及巨大的生物资源也将
11、综述生命科学仪器 2023 第21卷/1期13会在得到其纯培养后展现出来。1.3 微生物培养的限制因素获得纯培养微生物的限制因素有很多:(1)活的但不可培养(VBNC)状态26。众所周知,产生芽孢是部分微生物抵抗不良环境的策略,Colwell等人发现了不能形成芽孢的细菌的一种抵御不良生存环境的机制VBNC27,大多数进入VBNC状态的微生物在实验室条件下无法培养;(2)微生物自然生境复杂28。自然环境复杂多样,现有技术条件无法完全复刻微生物原生环境;(3)检测技术不够灵敏。缺乏针对低丰度或缓慢生长微生物的检测手段,导致部分微生物培养丢失;(4)培养基富营养化。并非所有的微生物都适合在营养丰富的
12、条件下生长29,高营养的培养基可能会抑制某些生长缓慢微生物的生长30;(5)忽略了微生物间的物质交换与信息交流31,微生物的分离培养很可能是造成微生物不可培养的主要原因之一。为了解除以上微生物培养的限制因素,研究者们开发了许多新型微生物培养装置与技术,助力微生物资源的开发与利用。2 微生物培养新方法2.1 对传统培养方法的改进微生物传统的培养方法包括稀释倒平板法、涂布平板法、平板划线法、稀释摇管法等,但这些方法无法改变环境中微生物的低培养性,人工创造的生存环境及营养物质并不能满足大部分微生物的生长需要32。经过漫长的探索,我们已经开发出多种微生物培养方法,不断发展和改进现有微生物培养方法也是我
13、们提高微生物培养效率的重要手段。2.1.1 传统培养基的优化培养基的优化主要是调整培养基的成分,在传统培养基中添加某些特殊物质,如添加某些信号物质乙酰高丝氨酸内酯类化合物33、氨基酸、多肽类等等,改善微生物的培养状况,如精氨酸可以诱导白色念珠菌菌丝形成34;添加某些微生物生长因子35、金属离子CuSO45H2O、FeSO47H2O、ZnSO4等促进微生物的生长及其代谢产物产生,如添加CuSO45H2O使枯草芽孢杆菌核黄素的产量有了明显的提高36。2.1.2 寡营养培养过去对微生物的培养人们倾向于为微生物提供丰富且充足的营养物质,但是培养效率却往往达不到我们的预期。这种现象说明并非所有的微生物都
14、适合在营养丰富的条件下生长。在自然环境中占主导地位的许多微生物不适合在含有高浓度复杂碳源的培养基上生长,许多微生物可能需要营养不足或其他苛刻的条件才能培养成功29。2010年,Senechkin 等人定义“oligotrophs”,即能够在(极)低营养素利用率下生长的细菌,也叫寡养菌37。Ilya等人将稀释的样品悬浮液接种到新鲜的低碳和高碳琼脂培养基中,低碳琼脂培养基具有与高碳琼脂培养基相同的组成,但酶促酪蛋白水解物和葡萄糖比高碳培养基低100倍38。孵育后,选择在高碳琼脂培养基上没有形成的菌落但在低碳培养基上形成的菌落,再次转移到新鲜的低碳和高碳琼脂培养基中进行培养,重复上述操作直到第十次转
15、移完成,该方法有效的实现了环境中部分寡养菌的培养。寡养菌不同于其他细菌群体,它们更喜欢低营养环境。因此,可以利用特定限制能源的培养基,如低碳培养基从环境中分离培养寡养菌。2.2 基于共培养的培养方法自然界中的微生物与人类一样都是“群居”生活,微生物间存在十分复杂的联系。微生物共培养模拟了自然界中微生物间的相互作用,允许不同菌体通过释放特殊代谢物质进行交流,从而促进微生物生长。为达到此目的,近些年有以下一些经典的共培养方法。2.2.1 双面培养皿(Double-sided Petri dish,DSPD)2021年,Yuan等人设计并使用了一种真菌共培养装置双面培养皿39(DSPD,图1),实现
16、了红曲霉和黑曲霉的共培养。DSPD主体由两个直径为9 cm的培养皿组成,每个DSPD包括一个主体部分综述生命科学仪器 2023 第21卷/1期14和两个盖子。首先,用胶水将两个培养皿的底部粘在一起,然后在培养皿中间钻一个直径2cm的孔,装置主体制作完成。然后将两张直径9 cm的圆形无菌玻璃纸粘贴在DSPD两侧,覆盖培养皿上的孔,防止培养基泄漏。将培养基倒入DSPD中,待培养基固化后接种微生物。代谢产物、信号因子等可以由生长在DSPD一侧的微生物菌株产生并通过培养皿上的孔作用于另一侧的菌株,以此实现不同菌株的共培养。该装置结构简单,便于操作,但目前报道较少,培养效率有待进一步验证。图1 双面培养
17、皿(DSPD)示意图39Fig.1 The structure drawing of Double-sided Petri dish(DSPD)392.2.2 SVCS装置(Submerged volatile co-culture system)图2 SVCS示意图40Fig.2 he schematic diagram of SVCS402020年,Fatemeh等人为了探索挥发性有机化合物对微生物次生代谢产物产生的途径和最终形成的产物的影响,组装了一种新型共培养装置Submerged volatile co-culture system(SVCS,图2)40。该装置将一个100mL玻璃培
18、养瓶作为主培养瓶,连接一个、两个或三个100mL含有不同真菌或细菌的玻璃培养瓶,培养瓶中盛有适于微生物生长的培养基。所有的培养瓶上方均由玻璃细管连通,主培养瓶上方玻璃管口用棉花填充,作为过滤器,只允许挥发性物质通过,防止其他培养瓶中的微生物菌体进入主培养瓶。Fatemeh等人用该装置成功验证了13种真菌和细菌对灵芝胞外多糖生产的影响。该装置可以同时分别验证多种微生物间的相互作用,结构简单,易于操作。不足之处便是该装置具有局限性,只能应用于验证微生物挥发性的代谢产物对其他微生物的影响。2.2.3 海绵-细菌共培养装置2019年,Knobloch等人开发了一种海绵-细菌共培养装置(如图3),用来分
19、离培养海绵共生细菌41,这是一种依靠半透膜分离海绵外植体和微生物的共培养装置。该装置改良Bio-Dot SF(Bio-Rad)微量过滤器(BioHit)42作为装置的上半部分,先将海绵外植体切碎放入BioHit孔中,再将装置底部每个腔室都充满培养基。待培养基凝固后,将海绵细菌稀释液接种在每个腔室的培养基上,随后在其上方覆盖一层0.2 m的滤膜和七层25 m的滤纸,最后将含有海绵外植体的微滤器上半部分和装置底部固定在一起,放于海水中进行原位培养。该装置对海绵共生微生物有显著的富集效果,可以将其置于实验室环境进行培养,也可以将其放入海绵微生物原生环境进行培养,将共培养与原位培养结合应用,但富集后的
20、分离纯培养还需要继续探索。图3 海绵-细菌共培养装置示意图43Fig.3 The schematic diagram of sponge-bacteria co-cultivation device432.2.4 单菌落共培养装置2015年,Tanaka等人设计了单菌落共培养装置(图4)44,该装置的最外层是培养皿,培养皿内装有聚丙烯隔环和滤膜。开始将1.5%琼脂培养基铺在培养皿最底层,将再0.4%软琼脂培养基(含有某种待共培养的细菌)铺在凝固后的底层培养基上,随后将带有滤膜的聚丙烯隔环即薄膜过滤器铺在上方,最后在过滤器上方倾倒0.4%软琼脂培养基(含有另一种待共培养的细菌),上综述生命科学仪
21、器 2023 第21卷/1期15层和下层的菌体共享某些可溶性物质,这些物质可以穿过膜过滤器在各层培养基之间扩散,而菌体则无法穿透膜过滤器,经过一段时间的培养,观察表面菌落的生长状况。利用单菌落共培养装置成功培养出了之前不可培养的副杆状菌(Parabacteroides)并筛选出多组能够相互促进生长的菌株。该装置一定程度上克服了人工培养阻碍微生物间通信交流的问题,但并不适用于好氧菌的培养。图4 单菌落共培养装置示意图44(a)培养皿中膜过滤器整体图(b)共培养系统:1、隔环;2、上层软琼脂培养基;3、0.02 m滤膜;4、下层软琼脂培养基;5、琼脂基层Fig.4 The structure dr
22、awing of Single-colony coculture technique44(a)Overview of the membrane filter-bottom ring in a petri dish.(b)Diagram of the coincubation system:1,spacer ring;2,upper layer of soft agar medium;3,0.02 m membrane filter;4,lower layer of soft agar;5,basal layer of soft agar2.3 基于原位培养的培养方法绝大多数微生物只能在其自然生
23、境中生长繁殖,无法实现实验室生长,原因就在于实验室无法满足微生物生长所需的所有条件,原位培养正是解决这一问题的关键。微生物原位培养的重点在于将微生物置于自然栖息地进行培养,利用微生物自然生境为其生长繁殖提供所需条件。近年来,基于原位培养开发的微生物培养装置培养效率可观,挖掘出许多不可培养微生物资源。2.3.1 DHS(Down-flow hanging sponge)生物反应器2022,Hiroyuki等人通过使用Down-flow hanging sponge生物反应器(DHS,图5)和选择性分批培养来富集深海不可培养微生物45。该技术最初由Harada研究组开发,这种反应器最初被研制出来是
24、为了处理发展中国家城市污水,是一种高效的废水处理系统46。DHS主体是长113 cm、直径6.5 cm的玻璃管,管中为多个小海绵块连起的海绵柱,玻璃管下管口附近的气孔可通入CH4、CO2等微生物所需的气体,上管口附近的气孔用于废气的排放。从玻璃管上管口连续灌入培养基,培养基从上至下流经海绵块为微生物供能。装置使用的海绵具有高孔隙率(80%)的网状结构,为微生物生长提供了充足的空间,可以在连续缓慢供给新鲜培养基和能量的同时将细胞保留在海绵中。这种连续流动有助于模拟微生物自然生长环境,人工控制培养基流速,允许持续供应低浓度底物(即稳定的贫营养条件),同时随着底物的不断流动去除潜在的抑制性废物。但该
25、装置体积较大,只能在实验室进行原位培养模拟实验;目前关于该装置的报道较少,适用范围有待进一步研究。图5 DHS生物反应器示意图45Fig.5 The schematic diagram of DHS Bioreactor452.3.2 Isolation-Tip装置(I-tip)图6 I-tip 装置图47综述生命科学仪器 2023 第21卷/1期16Fig.6 The schematic diagram of the I-tip472014年,Jung 等人开发了一种微生物原位培养装置Isolation-Tip(I-tip,图6)47,用于从白卡利亚海绵中培养微生物。使用移液器黄色枪头作为装
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