Box-Behnken响应面法优化荷叶离褶伞液体发酵培养基.pdf
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1、 文章编号:1 6 7 4-1 4 8 X(2 0 2 3)0 3-0 1 8 2-0 6B o x-B e h n k e n响应面法优化荷叶离褶伞液体发酵培养基于亚宁1,邱田美1,侯杰1,于浩1,王鑫民1,高霞2,康莉莉3,李丽珍3,刘鹏3,徐丽丽1(1.青岛农业大学生命科学学院/山东省应用真菌重点实验室,山东青岛 2 6 6 1 0 9;2.山东省农业技术推广总站,山东济南 2 5 0 0 1 3;3.甘肃高科农牧生态有限公司,甘肃定西 7 4 8 0 0 0)摘 要:为了优化菌丝培养基以期提高菌丝生物量和氨基酸产量,以荷叶离褶伞菌丝体为试验材料,以生物量和氨基酸含量为指标,利用B o
2、x-B e h n k e n响应面法优化液体发酵培养基。试验结果表明:液体发酵最优培养基配方为马铃薯2 0 0 g/L、葡萄糖2 5 g/L、麸皮7.7 5 g/L、KH2P O4 1.5 g/L、M g S O4 1.6 2 g/L;每1 0 0 m L液体培养基可得菌丝体生物量为1.0 9 60.0 2 5 g,菌球大小均匀、菌球浓密,且优化后的菌丝体总氨基酸含量提高了2 3.9%,子实体总氨基酸含量高达1 7.0 6%。优化培养基可用于荷叶离褶伞液体发酵工厂化生产。关键词:荷叶离褶伞;菌丝体;B o x-B e h n k e n响应面法;氨基酸中图分类号:S 6 4 6.1文献标识码
3、:AD O I:1 0.3 9 6 9/J.I S S N.1 6 7 4-1 4 8 X.2 0 2 3.0 3.0 0 4收稿日期:2 0 2 3-0 4-1 0基金项目:山东省现代农业产业技术体系食用菌产业体系项目(S D A I T-0 7-0 2);山东省大学生创新训练项目(S 2 0 2 1 1 0 4 3 5 1 5 6)作者简介:于亚宁(2 0 0 1),女,在读本科,主要研究方向为应用真菌。E-m a i l:m 1 9 8 0 5 4 2 5 7 2 51 6 3.c o m 通信作者:徐丽丽(1 9 7 9),女,讲师,硕士,主要研究方向为应用真菌。E-m a i l:E
4、 l l y x u 1 6 3.c o m O p t i m i z a t i o n o f L y o p h y l l u m D e c a s t e s L i q u i d F e r m e n t a t i o n M e d i u m b y B o x-B e h n k e n R e s p o n s e R u r f a c e M e t h o dYU Y a n i n g1,Q I U T i a n m e i1,HOU J i e1,YU H a o1,WANG X i n m i n1,GAO X i a2,KANG L i l i3
5、,L I L i z h e n3,L I U P e n g3,XU L i l i1(1.C o l l e g e o f L i f e S c i e n c e s,Q i n g d a o A g r i c u l t u r a l U n i v e r s i t y/S h a n d o n g P r o v i n c e K e y L a b o r a t o r y o f A p p l i e d M y c o l o g y,Q i n g d a o 2 6 6 1 0 9,C h i n a;2.S h a n d o n g P r o v
6、 i n c e A g r i c u l t u r a l T e c h n o l o g y P r o m o t i o n S t a t i o n,J i n a n 2 5 0 0 1 3,C h i n a;3.G a n s u H i g h-t e c h A g r i c u l t u r e a n d A n i m a l H u s b a n d r y E c o l o g y C o.,L t d.,D i n g x i 7 4 8 0 0 0,C h i n a)A b s t r a c t:I n o r d e r t o o p
7、 t i m i z e m y c e l i u m m e d i u m t o i m p r o v e m y c e l i u m b i o m a s s a n d a m i n o a c i d y i e l d,B o x-B e h n k e n r e s p o n s e s u r f a c e m e t h o d w a s u s e d t o o p t i m i z e l i q u i d f e r m e n t a t i o n m e d i u m w i t h m y c e l i u m f r o m l
8、 o t u s l e a f a s t e s t m a t e r i a l a n d w i t h b i o m a s s a n d a m i n o a c i d c o n t e n t a s i n d e x e s.T h e e x p e r i m e n t a l r e s u l t s s h o w e d t h a t t h e o p t i m a l m e d i u m f o r m u l a f o r l i q u i d f e r m e n t a t i o n i n c l u d e d p o
9、 t a t o 2 0 0 g/L,g l u c o s e 2 5 g/L,b r a n 7.7 5 g/L,KH2P O4 1.5 g/L,a n d M g S O4 1.6 2 g/L.T h e b i o m a s s o f a v a i l a b l e m y c e l i u m p e r 1 0 0 m L o f l i q u i d m e d i u m w a s 1.0 9 60.0 2 5 g,t h e m y c e l i u m b a l l w a s u n i f o r m a n d d e n s e,t h e t o
10、 t a l a m i n o a c i d c o n-t e n t o f t h e o p t i m i z e d m y c e l i u m w a s i n c r e a s e d b y 2 3.9%,a n d t h e t o t a l a m i n o a c i d c o n t e n t o f t h e f r u i t i n g b o d y w a s a s h i g h a s 1 7.0 6%.T h e o p t i m i z e d m e d i u m c a n b e u s e d f o r t h
11、 e f a c t o r y p r o d u c t i o n o f l i q u i d s t r a i n o f L y o p h y l l u m d e c a s t e s.K e y w o r d s:L y o p h y l l u m d e c a s t e s;m y c e l i u m;B o x-B e h n k e n r e s p o n s e s u r f a c e m e t h o d;a m i n o a c i d青岛农业大学学报(自然科学版)4 0(3):1 8 21 8 7,2 0 2 3J o u r
12、n a l o f Q i n g d a o A g r i c u l t u r a l U n i v e r s i t y(N a t u r a l S c i e n c e)荷叶离褶伞(L y o p h y l l u m d e c a s t e s)俗称鹿茸菇,属担子菌亚门(B a s i d i o m y c o t i n a),伞菌目(A g a r-i c a l e s),白 蘑 科(T r i c h o l o m a t a c e a e),离 褶 伞 属(L y o p h y l l u m)1。荷叶离褶伞是一种珍贵的食药兼用大型真菌,广泛分布
13、于北半球的温带地区2。其味道鲜美、口感脆滑、营养丰富,含有丰富的膳食纤维3,具有较高的营养价值。荷叶离褶伞含有多种活性物质,具有提高免疫力、抑制肿瘤生长4、抗菌5-6、降低血糖和血脂7-8等功效。目前,国内对荷叶离褶伞的工厂化栽培技术已经非常成熟。2 0 0 0年,魏生龙等9通过瓶栽和袋栽实现了祁连山野生荷叶离褶伞的驯化栽培,成功获得子实体;2 0 0 7年,设施化栽培荷叶离褶伞在上海丰科生物科技股份有限公司成功实现1 0。近年来,荷叶离褶伞产量迅速增长,未来荷叶离褶伞在食用菌加工以及保健食品开发等方面具有广阔应用前景。但程继红1 1在对荷叶离褶伞进行工厂化栽培的研究中发现荷叶离褶伞抗杂菌能力
14、很弱,固体菌种生产周期长、成本高且易退化,而液体菌种具有制作周期短、成本低、易操作且菌龄一致等优势,且在金针 菇、杏 鲍 菇 等 常 见 食 用 菌 生 产 中 已 广 泛 应用1 2。目前关于荷叶离褶伞液体发酵培养研究较少,为了优化菌丝生长环境,本研究采用B o x-B e-h n k e n响应面法对荷叶离褶伞液体发酵培养条件进行优化,并分析了液体发酵培养基优化前后子实体中氨基酸含量,以期为荷叶离褶伞的工厂化生产和栽培提供试验依据和技术支持。1 材料与方法1.1 试验材料1.1.1 供试菌株荷叶离褶伞菌种为青岛农业大学农业应用真菌实验室保存菌株。1.1.2 基础培养基成分基础 培 养 基
15、为 马 铃 薯2 0 0 g、葡 萄 糖2 0 g、KH2P O4 1 g、M g S O4 0.5 g、琼脂2 0 g、蒸馏水1 0 0 0 m L1 3。1.1.3 主要仪器SW-C J-2 F D型双人单面净化工作台,苏州净化设备有限公司;L D Z F-7 5 L立式高压蒸汽灭菌器,上海申安医疗器材厂;D P X-9 0 5 2 B-1电热恒温培 养箱,上海福玛试验设备有限公司;日立8 9 0 0高速氨基酸分析仪,株式会社日立制作;P K-1 6 A高速冷冻离心机,德国艾本德股份公司;打孔器、电子天平等。1.2 试验方法1.2.1 B o x-B e h n k e n响应面法试验设计
16、以葡萄糖添加量为因子A,麸皮添加量为因子B,M g S O4添加量为因子C,以发酵液中培养菌丝体的生物量为响应变量,根据B o x-B e h n k e n的试验原理,进行三因素三水平的B o x-B e h n k e n响应面分析试验1 4-1 7。B o x-B e h n k e n响应面是一种统计学方法,用于研究多变量系统中的变量之间相互作用,通过D e s i g n e x p e r t 1 2.0.3以确定液体培养基最优条件。荷叶离褶伞液体培养B o x-B e h n k e n响应面试验因子及水平设计见表1。表1 B o x-B e h n k e n响应面试验因子与水
17、平T a b l e 1 B o x-B e h n k e n r e s p o n s e s u r f a c e t e s t f a c t o r s a n d l e v e l s单位:g/L 水平l e v e l sA葡萄糖A G l u c o s eB麸皮B B r a nC硫酸镁C M g S O4-12 251.202 51 01.512 81 51.81.2.2 液体菌种制备及液体培养 菌种制备:选取活化后的荷叶离褶伞菌种制备液体菌种。在2 5 0 m L三角瓶中装入1 0 0 m L液体培养基,1 2 1 灭菌2 0 m i n,冷却至室温。用直径5 m
18、m打孔器在活化好的平板上打菌饼,每瓶液体培养基接种5块菌饼,于2 5、1 3 0 r/m i n条件下恒温振荡培养7 d,即得到液体菌种。液体培养:取5 m L 液体菌种接种于2 5 0 m L的三角瓶中,加入1 0 0 m L的液体培养基,于2 5、1 3 0 r/m i n条件下恒温振荡培养7 d。1.2.3 菌丝生物量测定将培养7 d的发酵液放在4 低温离心机中,以转速1 0 0 0 0 r/m i n离心1 0 m i n,收集菌球,用蒸馏水洗涤菌球3次,置于烘干的洁净培养皿上,于干燥箱中在6 0 下烘干至恒重,即为菌丝生物量1 8。1.2.4 菌丝体的氨基酸含量分析将活化的荷叶离褶伞
19、菌种分别接种在基础培养基和B o x-B e h n k e n响应面法优化后的培养基中,于2 5、1 3 0 r/m i n条件下恒温振荡培养7 d。过滤菌丝并使用蒸 馏水清洗3次,烘干菌 球,采用日立8 9 0 0高速氨基酸分析仪,参考G B 5 0 0 9.1 2 42 0 1 6食品中氨基酸的测定1 9标准,分析测定荷叶离褶伞菌株中的氨基酸成分及含量。381 3期 于亚宁,等:B o x-B e h n k e n响应面法优化荷叶离褶伞液体发酵培养基 1.3 数据处理与分析采用E x c e l 2 0 1 6、S P S S 2 1.0和D e s i g n e x p e r t
20、 1 2.0.3对试验数据进行处理和分析。2 结果与分析2.1 液体发酵培养基优化结果2.1.1 B o x-B e h n k e n 试验设计和模型的可行性分析试验设计的组合以及试验结果如表2所示,用B o x-B e h n k e n响应面法对试验结果进行回归方程的方差分析如表3所示,荷叶离褶伞液体发酵培养基的多项式回归方程为:Y=1.0 6-0.0 2 5 4A-0.0 3 9 6B-0.0 2 2 7 C-0.0 1 4 6A B+0.0 5 7 8A C-0.0 5 5 9B C-0.0 2 3 4 A2-0.0 8 5 4B2-0.0 7 3 1C2式中,A为葡萄糖的用量(g/
21、L);B为麸皮的用量(g/L);C为M g S O4的用量(g/L);Y为荷叶离褶伞菌丝体生物量(g/L)。由表3可知,A、C和A B因素影响不显著,其他项在模型中均达到了显著水平。本试验使用模型的P值为0.0 0 3 7(P0.0 5),表明本模型失拟项并不显著,这说明本试验所使用模型与试验所拟合结果无显著差异,因此该模型可以用来对荷叶离褶伞菌丝培养基的组分进行优化。正交系数R2A d j为0.8 2 4 8,说明该模型存在1 7.5 2%的变异表2 B o x-B e h n k e n响应面试验结果T a b l e 2 B o x-B e h n k e n r e s p o n s
22、 e s u r f a c e t e s t r e s u l t s 试验编号T e s t n u m b e rABC菌丝体生物量/(g/L)M y c e l i a l b i o m a s s1-1-101.0 1 0 721-100.9 7 8 83-1100.9 5 4 641100.8 6 4 35-10-11.0 6 2 4610-10.9 0 6 17-1010.9 0 7 081010.9 8 1 990-1-10.9 0 8 51 001-10.9 4 7 31 10-110.9 6 9 31 20110.7 8 4 51 30001.0 9 7 41 400
23、00.9 8 3 21 50001.0 9 4 71 60001.0 7 3 91 70001.0 5 5 5度,使用本试验所得的多项式回归方程可以解释8 2.4 8%的试验数据。此多项式回归方程模型的判定系数为9 2.3 4%,表明本试验所建立的模型拟合度较好。表3 B o x-B e h n k e n响应面拟合回归方程的方差分析T a b l e 3 ANOVA a n a l y s i s o f t h e B o x-B e h n k e n r e s p o n s e f a c e f i t r e g r e s s i o n e q u a t i o n方差来
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