白花蛇舌草对人白血病细胞株HL-60增殖、凋亡及PI3K_AKT和Wnt_β-catenin信号通路的影响.pdf
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1、白花蛇舌草对人白血病细胞株 增殖、凋亡及 和 信号通路的影响邹 琳,方 烨,何 威基金项目:湖北省自然科学基金项目()作者单位:武汉,中部战区总医院综合科作者简介:邹琳,硕士研究生,主治医师。主要从事血液病方向研究通讯作者:何威,:摘要 目的 探究白花蛇舌草对人白血病细胞株 增殖、凋亡的影响及其作用机制。方法 将 细胞随机分为 组、组、组和 组,分别采用、浓度白花蛇舌草处理。流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期分布;法检测线粒体膜电位;检测、蛋白表达水平。结果 与 组比较,、组细胞凋亡率和 期比例明显升高,期比例和线粒体膜电位明显降低,比值升高,、蛋白表达水平和 比值降低,差异均有统计学意义()。
2、结论 白花蛇舌草通过 、信号通路抑制 细胞增殖,诱导细胞凋亡。关键词 白血病;白花蛇舌草;细胞;细胞凋亡;细胞周期;线粒体膜电位;信号通路;信号通路中国图书资料分类号 文献标志码 文章编号(),;,();白血病是一种异质性血液系统恶性肿瘤,起源于骨髓造血干细胞,其恶性程度高、发展迅速,近年来发病率呈升高趋势。在临床上化疗是治疗白血病的首要方式,但化疗容易出现耐药,而且其毒副作用对机体免疫和造血系统有较大的损伤。因此,临床迫切需要探寻一种毒副作用小、治疗效果好的抗白血病药物。白花蛇舌草是一种传统的中草药,具有清热解毒、祛瘀的功效,在抗肿瘤方面具有显著疗效,能够有效抑制大肠癌、肺癌、肝癌、宫颈癌、
3、喉癌等肿瘤细胞的增殖活性。先前研究已表明,白花蛇舌草能够促进白血病 细胞的凋亡,还可以抑制白血病 细胞增殖并诱导其凋亡。但白花蛇舌草对白血病的具体作用机制仍不清楚,本文旨在探究白花蛇舌草对人白血病细胞株 增殖及凋亡的影响及其作用机制。临床误诊误治 23 年 6 月 第 36 卷 第 6 期 熏 36熏 6 Jun 23 材料与方法 药物与试剂白花蛇舌草()购自浙江中医药大学中药饮片有限公司;培养基()、胎牛血清()、青 链霉素()、胰蛋白酶()购自武汉博士德生物工程有限公司;裂解液()、蛋白浓度检测试剂盒()、细胞凋亡检测试剂盒()、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔()购自上海碧云天生物技术有限公司
4、;兔抗()、()、()、()、()、()、()、()、()、()、()单克隆抗体购自英国 公司。细胞培养人白血病细胞株 来源于中国科学院细胞库,细胞培养在含 胎牛血清和 青 链霉素的 培养基中,置于 、的细胞培养箱中,培养基每 天更换 次,以保证细胞营养,直至细胞达到 融合。法检测细胞活力在 孔板中每孔加入细胞 ,再加入不同浓度的白花蛇舌草(、)培养 ,然后将 试剂()加入每个实验孔,并培养 。弃去培养基,每孔加入 二甲基亚砜,用酶标仪检测 处的吸光度值。计算白花蛇舌草对 细胞的半数抑制浓度()值。细胞处理及分组根据白花蛇舌草对 细胞的 值,选择、和 的白花蛇舌草处理 细胞。将 细胞随机分为
5、组:组、组、组和 组。流式细胞仪检测细胞凋亡按每板 个细胞的密度将 细胞铺至 培养板中,分别用、和 白花蛇舌草处理 。收集细胞并用磷酸盐缓冲液()洗涤。再用 膜联蛋白结合缓冲液重新静置后,根据试剂盒说明书的操作步骤,使用 和 染色 ,并用流式细胞仪进行检测。流式细胞仪检测细胞周期 细胞分别用、和 白花蛇舌草处理 后,离心 ,清洗 次,重悬调整细胞浓度为 ,取 细胞悬液,离心 ,预冷乙醇固定,加 和 至终浓度 ,水浴 ,用流式细胞仪测定细胞周期。法检测线粒体膜电位 细胞分别用、和 白花蛇舌草处理 后,加入 染料 条件下避光培养 。各组细胞以 离心 ,并用分析缓冲液洗涤 次。最后,添加 分析缓冲液
6、,并用流式细胞仪对细胞进行分析。检测相关蛋白表达使用 裂解液分离各组 细胞总蛋白,蛋白质浓度用 蛋白浓度检测试剂盒测定,硫酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白,并将目的蛋白带转移到 膜上,脱脂奶粉封闭膜,然后加入相应的一抗在 条件下孵育过夜。将膜与辣根过氧化物酶标记的 二抗在室温下孵育 。最后,使用 化学发光底物试剂观察蛋白条带,并用 软件定量分析蛋白表达水平。统计学方法应用 软件对数据进行统计学分析。计量资料以均数 标准差()表示,两两比较采用独立样本 检验。为检验水准。结果 白花蛇舌草对 细胞活力的影响与 白花蛇舌草比较,、白花蛇舌草处理能显著降低 细胞活力()。白花蛇舌草对 细胞的 值为 ,
7、因此选择、和 白花蛇舌草进行后续实验。见图。1501005000?1.53?6?12?24?48?96?细胞活力/%白花蛇舌草/(mol/L)与 白花蛇舌草比较,。图 不同浓度白花蛇舌草对 细胞活力的影响临床误诊误治 23 年 6 月 第 36 卷 第 6 期 熏 36熏 6 Jun 23 白花蛇舌草对 细胞凋亡的影响与 组比较,、组细胞凋亡率显著升高()。见图。细胞凋亡率/%4030201000?mol/L 组3?mol/L 组6?mol/L 组12?mol/L 组与 组比较,。图 不同浓度白花蛇舌草对 细胞凋亡的影响 白花蛇舌草对 细胞周期分布的影响与 组比较,、组 期比例明显升高,期比例
8、明显降低()。见图。G2/M 期S 期G1 期周期分布/%1501005000?mol/L 组3?mol/L 组6?mol/L 组12?mol/L 组与 组比较,。图 不同浓度白花蛇舌草对 细胞周期分布的影响 白花蛇舌草对 细胞线粒体膜电位的影响与 组比较,、组线粒体膜电位明显降低()。见图。白花蛇舌草对 细胞 、信号通路的影响与 组比较,、组 比值显著升高,、蛋白表达水平和 比值显著降低()。见图、。讨论 白血病是一种异质性恶性肿瘤,其特点是不成熟的克隆性髓系细胞增殖和分化异常。白花蛇舌草属于茜草科,是一种广泛分布于东北亚的中草药。现代药理学研究表明,白花蛇舌草对肝癌、肺癌、结肠癌、前列腺癌
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