菜豆黄花叶病毒RPA-LFD技术快速检测方法的建立与应用.pdf
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2、动试纸条()检测方法相结合,建立 快速检测方法,并进行特异性和灵敏度验证。结果表明,该方法可在 等温条件下进行,即可完成检测。灵敏度试验表明,采用 方法检测 的灵敏性是 方法的 倍。在特异性试验方面,与同属于马铃薯 病毒属亲缘关系较近的大豆花叶病毒(,简称 )、菜豆普通花叶病毒(,简称 )和芜菁花叶病毒(,简称 )无交叉反应。因此,本研究建立的菜豆黄花叶病毒 技术检测快速、灵敏且高效,有望成为我国菜豆黄花叶病毒田间诊断与防控的实用性技术手段。关键词:菜豆黄花叶病毒;重组酶聚合酶扩增;侧向流动试纸条;病毒检测中图分类号:文献标志码:文章编号:()收稿日期:基金项目:国家食用豆产业技术体系建设专项
3、(编号:);江苏现代农业(特粮特经)产业技术体系集成创新中心项目(编号:)。作者简介:朱宇翔(),男,江苏南通人,硕士研究生,从事豆类作物病毒病的研究。:。通信作者:崔晓艳,博士,研究员,从事大豆花叶病毒及豆类作物抗病遗传育种研究,:;陈学好,博士,教授,从事黄瓜品质性状和抗逆性状研究,:。菜豆黄花叶病毒(,简称 )是马铃薯 病毒属的成员,属于正义单链 病毒,全长 ,基因组编码一条多聚蛋白,该多聚蛋白裂解成 个编码蛋白:、和 。研究人员常用外壳蛋白()作为株系划分的一个标准,它作为重要的结构蛋白,主要参与病毒的运动和介体传播 。首次在 年被报道,随后在世界各个国家广泛传播 。寄主范围特别广泛,
4、主要侵染豌豆和蚕豆 。通常以种子带毒和蚜虫非持久性传播为主,也可通过汁液摩擦接种的方式传毒。蚕豆受病的叶片一般会表现出系统花叶、斑驳等症状,严重时会造成植株畸形,严重影响作物的产量及品质 。目前菜豆黄花叶病毒已经成为世界范围内的流行性植物病毒,造成豆科植物以及其他多种田间作物的大面积减产。关于菜豆黄花叶病毒的防治方法以选育优良的抗江苏农业科学 年第 卷第 期病品种为主,田间管理时应注意蚜虫的防治并结合合理的药剂防治,防止病毒病相互传染,加重病情。因此,快速且高效的检测方法对防控菜豆黄花叶病毒至关重要。目前已报道的菜豆黄花叶病毒的检测方法主要有酶联免疫吸附()法 ,包括直接抗原包被 和双抗体夹心
5、 。然而,该方法检测灵敏度低,且需要高质量的抗体 ;聚合酶链式反应()及 法包括 、一步实时定量 、免疫捕捉 。该方法具有较高的灵敏度和特异性,被广泛使用,但 对菜豆黄花叶病毒的检测需要提取 、反转录、扩增、琼脂糖凝胶电泳及成像检查扩增子等 。步骤繁琐、耗时长、需要大型昂贵仪器,不适合野外现场的快速检测 。重组酶聚合酶扩增()作为一种新型的等温分析法,能够对植物病原体内的 或 进行高度特异和有效的检测。已经广泛应用于细菌、真菌和病毒的分子检测。等基于柑橘黄龙病病原菌()保守的 基因设计特异性引物对和探针,结合侧向流动试纸条建立了 检测体系 ;等利用便携式实时荧光检测仪完成了对甘蓝型油菜茎基溃疡
6、病()的快速检测 ;等首次应用 检测李痘病毒(,简称 )后,逐渐应用在植物病毒的检测上 ,比如番茄黄化曲叶病毒(,简称简称 )、菜豆荚斑驳病毒(,简称 )、樱桃病毒(,简称 )、紫云英矮缩病毒(,简称 )、黄瓜花叶病毒(,简称 ),显示了其可应用于检测菜豆黄花叶病毒的潜力。利用链置换聚合酶、重组酶和单链 结合蛋白()进行 变性 ,通过包括凝胶电泳、基于探针的荧光监测或简单的非仪器“夹心分析”,如侧向流动试纸条等方法进行检测,该方法无需大型昂贵仪器进行扩增、电泳等繁琐步骤,恒温的条件下,短时间内即可观察结果。该方法简单、快速、高效,非技术人员也可直接操作,对现场菜豆黄花叶病毒病株快速检测具有良好
7、的应用潜力。在本研究中,建立了基于 检测 的方法,开发引物和探针,不仅测试了对 的特异性,而且可对 和 灵敏度进行比较。同时,检测技术可以快速且有效地检测出田间病样中的 。材料与方法 材料 年,从江苏和云南不同地区收集 份表现出花叶症状的蚕豆病样。所有样本均 检测和序列测定后储存在江苏省农业科学院经济作物研究所实验室 冰箱。大豆花叶病毒()、菜豆普通花叶病毒()和芜菁花叶病毒()样本均储存在笔者所在课题组实验室。本试验于 年 月于江苏省农业科学院经济作物研究所完成。提取,合成使用天根生化科技(北京)有限公司的植物总 提取试剂盒提取蚕豆叶片的总 ,采用 微体积紫外可见分光光度计测定 提取物的纯度
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