COS对抗菌蛋白ANG4在肠道表达的诱导作用.pdf
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1、激光生物学报ACTALASERBIOLOGYSINICAVol.32 No.3June.2023第 32 卷第 3 期2023 年 6 月收稿日期:2023-03-28;修回日期:2023-04-02。基金项目:国家自然科学基金项目(31772633);湖南农业大学“双一流”建设项目(SYL2019050)。作者简介:贺宇文,高级经济师,主要从事兽药、畜禽产品质量安全的研究。*通信作者:陈韬,教授,主要从事动物肠道黏膜免疫分子生物学的研究。E-mail:chentao_。COS对抗菌蛋白ANG4在肠道表达的诱导作用贺宇文2,汤冠宇1,3,李楚楚1,李灿1,纪春晓1,陈韬1,3*(1.湖南农业大
2、学动物医学院,长沙 410128;2.湖南省兽药饲料监察所,长沙 410006;3.湖南省兽药工程技术研究中心,长沙 410128)摘要:血管生成素4(ANG4)是一种新型抗菌肽蛋白,具有抗菌、抗炎、血管生成、调节机体免疫反应等多种生物学功能,在机体先天免疫过程中发挥重要的作用。ANG4在新生小鼠肠道的表达受到多种因素的调节,如细菌信号和发育过程等。本试验选取细菌细胞壁表面分子的类似物壳寡糖(COS)作为诱导物,探究其对小鼠肠道ANG4表达和对肠道形态的影响。实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)和蛋白质免疫印迹(Western blot)分析表明,COS能增加小鼠肠道ANG4 mRNA
3、及ANG4蛋白的表达;形态学观察结果显示,COS使小肠绒毛高度明显增加,平均隐窝深度均有降低,V/C值增加,表明COS可通过诱导ANG4等抗菌蛋白的表达,或通过其杀菌和免疫调节作用而不同程度地提高小肠黏膜的完整性。研究结果为COS以及ANG4在仔猪肠道疾病防治的应用提供了理论依据。关键词:ANG4;COS;抗菌蛋白;实时荧光定量PCR;蛋白质免疫印迹中图分类号:Q78 文献标志码:A DOI:10.3969/j.issn.1007-7146.2023.03.006Inducing Effects of COS on Expression of Antimicrobial Protein ANG
4、4 in IntestineHE Yuwen2,TANG Guanyu1,3,LI Chuchu1,LI Can1,JI Chunxiao1,CHEN Tao1,3*(1.College of Veterinary Medicine,Hunan Agricultural University,Changsha 410128,China;2.Hunan Provincial Institution of Veterinary Drug and Feed Control,Changsha 410006,China;3.Hunan Veterinary Drug Engineering and Te
5、chnology Research Center,Changsha 410128,China)Abstract:Angiogenin 4(ANG4),a novel antimicrobial protein with multiple biological functions,such as antimicrobial,anti-inflammation,angiogenesis and regulating the bodys immune response,plays a key role in innate immunity.The expres-sion of ANG4 in neo
6、natal mice intestine is regulated by some factors including microbial signal and developmental stage.Being an analogue of surface molecules of bacterial cell wall,chitosan oligosaccharide(COS)was selected as a inducer to explore the effects on ANG4 expression and mophology in post weaning mice intes
7、tine.qRT-PCR and Western blot analyses showed that the mRNA and protein levels of ANG4 increased suggesting that COS can upregulate the expression of ANG4.The results of HE staining of mouse intestinal tract showed that the height of intestinal villi,the depth of crypt and the value of V/C increased
8、 significantly.It indicates that COS can improve the integrity of intestinal mucosae in some extent through either inducing the expression of some intestinal antimicrobial proteins,such as ANG4,or its antimicrobial and immunomodulation activities,and provide the theoretical basis for the application
9、s of COS and ANG4 in controlling the intestinal diseases in piglets.Key words:ANG4;COS;AMPs;qRT-PCR;Western blot (Acta Laser Biology Sinica,2023,32(3):234-239)235第 3 期血管生成素(angiogenin,ANG)在上世纪70年代被Folkman等作为肿瘤的血管生成因子分离,可参与实体肿瘤的形成、发展和迁移过程中极为重要的步骤1。近年来许多研究表明,ANG不仅能促进血管的生成,还能从多方面影响炎症的发生以及肠道菌群的稳态2-3。ANG
10、与血管内皮生长因子(vas-cular endothelial growth factor,VEGF)协同参与血管的形成以及调节血管内皮通透性。ANG4属于血管生成素家族,小鼠ANG4成熟蛋白由144个氨基酸残基组成,分子质量约16 kD4,是一种新型的抗菌蛋白,具有多种生物学功能,如促进血管生成5、促进黑色瘤细胞的增殖6和抗炎作用等7。ANG4主要在肠道和胰腺中表达8,对肠道中的细菌具有选择性毒性,如1 mol/L的ANG4处理2 h就能杀灭99%以上的致病菌粪肠球菌(Enterococcus faecalis)和单增李斯特氏菌(Listeria monocytogenes),而肠道共生菌大
11、肠杆菌K12(Escherichia coli)可耐受高达10 mol/L的ANG49。Hooper等9在小鼠小肠内发现了ANG4 mRNA,其主要在小肠的潘氏细胞中表达,且表达受到细菌信号的调节,尤其在小鼠断奶后期表达量可升高30多倍,这意味着ANG4在小鼠断奶后的免疫撤除和应激中发挥了重要的作用。壳寡糖(chitosan oligosaccharide,COS)是氨基葡萄糖或乙酰氨基葡萄糖通过-1,4糖苷键连接而成的聚合度为220的功能性低聚糖10,在结构上与细胞壁的主要成分肽聚糖(peptidoglycan,PG)和脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)相似。COS具有抗
12、菌11、抗氧化12、免疫调节和抗炎13-14等功能,同时COS还具有相对分子质量低、生物活性高、水溶性较好、无毒、易被动物体吸收利用等优点10。因此,COS作为饲料添加剂被广泛应用畜牧业生产。本实验室以前的研究表明,COS作为PG的类似物能明显上调小鼠肠道组织表达抗菌蛋白RegIII15。本研究拟以COS为诱导物,观察其对ANG4表达和肠道形态的影响,为断奶仔猪腹泻的防治提供理论基础。1材料与方法1.1试验材料1.1.1试验动物此动物试验的所有程序均符合 实验动物护理和使用指南,动物的使用经过湖南农业大学动物伦理委员会(43321503)的批准。本试验所用昆明小鼠(Mus musculus)购
13、于湖南嘉泰实验动物有限公司 许可证号:SCXK(湘)2015-0010 。选择12只怀孕母鼠(SPF级),饲养于湖南农业大学动物医学院第三教学楼动物房,正常采食与饮水。1.1.2主要试剂小鼠ANG4多抗(上海强耀生物);-actin、HRP标记山羊抗兔二抗(谷歌生物公司);Trizol(Takara生物技术有限公司);10%中性福尔马林固定液、0.9%生理盐水、COS溶液配制、30%聚丙烯酰胺溶液、1电泳缓冲液、1转膜缓冲液、10TBS、TBST、封闭液等均由实验室自行配制。1.2方法1.2.1试验设计与取样将12只孕鼠分笼饲养于动物饲养房中,平均温度为(232),相对湿度为(5010)%,正
14、常采食与光照。母鼠产仔后新生小鼠用于试验。COS处理参照孟江海等15,选定3个剂量组(200、600、1 000 mg/kg)。随机选取80只17日龄的小鼠(雌雄各半)用于试验,每组各20只小鼠。试验开始后,试验组开始连续灌胃COS溶液,对照组灌胃同样体积的生理盐水;各组分别于19、21、23、25 d取5只小鼠处死,取小鼠十二指肠、空肠、回肠、结肠组织分别储存,用于实时定量聚合酶链式反应(quantita-tive real-time PCR,qRT-PCR)、蛋白质免疫印迹(West-ern blot)和组织切片分析。1.2.2qRT-PCR检测小鼠肠道ANG4 mRNA的表达小鼠肠道总R
15、NA提取与qRT-PCR方法参照向琼昊等16所用方法,委托上海启因生物公司完成。qRT-PCR反应完成后,采用CT法计算检测基因mRNA相对表达量。1.2.3Western-blot检测小鼠肠道ANG4蛋白的表达肠道组织蛋白提取、定量及Western blot分析方法参照林梦雨等17所用方法,并用Image-Lab软件分析蛋白表达水平。1.2.4组织切片观察小鼠肠道组织变化将小鼠肠道组织取出,用生理盐水冲洗后放入中性福尔马林固定液中固定后用于苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin staining,HE)15,将切片置于显微镜下观察并采集图像。1.3数据处理与分析本试验所有数据分
16、析与作图均使用GraphPad 页眉文章标题贺宇文等:COS对抗菌蛋白ANG4在肠道表达的诱导作用 贺宇文等:COS对抗菌蛋白ANG4在肠道表达的诱导作用 激光生物学报236第 32 卷Prism软件,并用t检验等方法对相关数据进行差异显著分析。所有试验均重复3次,P0.05则统计无显著差异;P0.05则统计为差异显著,标记为*;P0.01则统计为差异极显著,标记为*。2结果与分析2.1不同剂量COS诱导对小鼠肠道ANG4 mRNA表达的影响通过qRT-PCR分析(图1),不同剂量的COS对ANG4 mRNA表达的影响是不同的:其中200 mg/kg组无论是在4个不同的部位,还是不同的时间点,
17、ANG4 的表达均无明显变化,在空肠甚至还有降低;而600和1 000 mg/kg组中ANG4 mRNA的表达均有显著上调,但剂量效应并不明显;同时在十二指肠、空肠和回肠中还表现出随发育阶段表达水平逐渐升高的趋势,但差异不明显,而这种变化趋势在结肠中并不明显。比较小肠不同部位ANG4 mRNA的表达水平,可以发现,600和1 000 mg/kg 2个剂量组中,十二指肠、空肠和回肠的整体表达水平要高于结肠。图1不同剂量COS诱导小鼠肠道ANG4 mRNA相对表达量Fig.1Relative expression of ANG4 mRNA in mouse intestines induced b
18、y different doses of COS2.2不同剂量 COS 诱导对小鼠肠道 ANG4 蛋白 表达的影响COS对小鼠肠道ANG4蛋白表达水平的影响见图2。和对照组相比,在200 mg/kg剂量组的十二指肠、空肠和回肠中ANG4表达水平无明显变化,不过在25 d稍有升高(P0.05);而600和1 000 mg/kg 2个组则从21 d 开始就有明显上调(P0.05),且呈现出随发育时间而升高的趋势,但2个剂量组的蛋白表达量与COS剂量无明显相关性;和小肠相比,结肠中的ANG4表达水平相对较低,和小肠相同的是200 mg/kg COS处理对ANG4的表达几乎没有影响,而600和1 00
19、0 mg/kg COS处理增加了ANG4的表达,这一结果与mRNA检测结果相符。2.3不同剂量COS对小鼠肠道形态的影响本试验通过HE染色来观察小鼠肠道不同节段的绒毛长度和隐窝深度以及其形态变化,结果如图3所示。所有剂量组与对照组相比,肠黏膜的整体结构无明显差异,但4个肠段的肠绒毛排列更加紧密。从图4可以看出,不同剂量的COS处理对于小肠的绒毛长度、隐窝深度、绒毛长度/隐窝深度比值(villus length/crypt depth,V/C)均有一定的影响。相对来说,200 mg/kg剂量组的影响最小,在十二指肠中以600 mg/kg剂量组更加明显,肠绒毛的高度增加,十二指肠隐窝深度有所下降,
20、V/C值整体升高,除23和25 d的隐窝深度差异显著(P0.05)。而在空肠和回肠中1 000 mg/kg剂量的影响更加明显。比较小肠的3个节段,COS处理对回肠形态的影响最大,1 000 mg/kg剂量的隐窝深度和V/C值均出现了明显的变化(P0.05)。237第 3 期图2不同剂量COS诱导小鼠肠道ANG4蛋白Western blot分析结果及相对表达量Fig.2Western blot analysis and relative expression of ANG4 protein in mouse intestines induced by different doses of COS
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