LY294002对过敏性鼻炎-哮喘综合征大鼠氧自由基、TRPV1神经元敏感性及TSLP表达的影响.pdf
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1、论著L Y 2 9 4 0 0 2对过敏性鼻炎-哮喘综合征大鼠氧自由基、T R P V 1神经元敏感性及T S L P表达的影响*李丽1 许翀2 柴若楠1(1.中国人民解放军北部战区总医院过敏反应科,辽宁 沈阳 1 1 0 0 1 6;2.锦州医科大学过敏反应科,辽宁 锦州 1 2 1 0 0 1)【摘要】目的 研究L Y 2 9 4 0 0 2对过敏性鼻炎-哮喘综合征(C A R A S)大鼠氧自由基、T R P V 1神经元敏感性及T S L P表达的影响。方法 将4 0只大鼠随机分为健康组(健康大鼠常规饲养)、模型组(卵蛋白致敏和鼻部滴注攻击法建立过敏性鼻炎-哮喘综合征大鼠模型)、治疗组
2、(模型+静脉注射L Y 2 9 4 0 0 2 0.5 m g/k g)、对照组(模型+布地奈德气雾剂)。E L I S A与免疫组织化学法检测T S L P表达,黄嘌呤氧化酶法检测S O D,T B A法检测MD A,HE 染色观察大鼠肺组织病理形态学变化,免疫荧光检测T R P V 1表达,免疫印迹检测N F-B、I B蛋白表达。结果 与健康组相比,模型组大鼠支气管及周围产生大量炎性细胞,支气管黏膜水肿、增厚,管腔狭窄,黏液分泌增多;与模型组比较,治疗组与对照组肺组织病理明显有所改善。与健康组相比,模型组T R P V 1、MD A、T S L P、N F-B升高,S O D、I B降低(
3、P0.0 5);与模型组相比,治疗组与对照组T R P V 1、MD A、T S L P、N F-B降低,S O D、I B升高(P0.0 5)。结论 通过抑制T R P V 1、T S L P、MD A并促进S O D表达,降低了C A R A S大鼠气道神经源性炎症、防止气道高反应性的产生并改善了氧化应激损伤及病理水平,从而发挥治疗作用。【关键词】L Y 2 9 4 0 0 2;过敏性鼻炎-哮喘综合征大鼠;氧自由基;T R P V 1、T S L P【中图分类号】R 7 6 5.2 1 【文献标志码】A D O I:1 0.3 9 6 9/j.i s s n.1 6 7 2-3 5 1 1
4、.2 0 2 3.0 9.0 0 6 基金项目:辽宁省自然基金资助项目(2 0 1 9-M S-3 5 6)通讯作者:柴若楠,E-m a i l:h u q u e c h e n 7 5 11 6 3.c o m引用本文:李丽,许翀,柴若楠.L Y 2 9 4 0 0 2对过敏性鼻炎-哮喘综合征大鼠氧自由基、T R P V 1神经元敏感性及T S L P表达的影响J.西部医学,2 0 2 3,3 5(9):1 2 7 6-1 2 8 1.D O I:1 0.3 9 6 9/j.i s s n.1 6 7 2-3 5 1 1.2 0 2 3.0 9.0 0 6E f f e c t s o f
5、 L Y 2 9 4 0 0 2 o n o x y g e n f r e e r a d i c a l,T R P V 1 n e u r o n s e n s i t i v i t y a n d T S L P e x p r e s s i o n i n a l l e r g i c r h i n i t i s-a s t h m a s y n d r o m e r a t sL I L i1,X U C h o n g2,C H A I R u o n a n1(1.D e p a r t m e n t o f A l l e r g y,G e n e r a
6、 l H o s p i t a l o f P L A N o r t h e r n T h e a t e r C o mm a n d,S h e n y a n g 1 1 0 0 1 6,C h i n a;2.D e p a r t m e n t o f A l l e r g y,J i n z h o u M e d i c a l U n i v e r s i t y,J i n z h o u 1 2 1 0 0 1,L i a o n i n g,C h i n a)【A b s t r a c t】O b j e c t i v e T o s t u d y t
7、 h e e f f e c t s o f L Y 2 9 4 0 0 2 o n o x y g e n f r e e r a d i c a l,T R P V 1 n e u r o n a l s e n s i t i v i t y a n d T S L P e x p r e s s i o n i n a l l e r g i c r h i n i t i s-a s t h m a s y n d r o m e r a t s.M e t h o d s F o r t y r a t s w e r e r a n d o m l y d i v i d e d
8、 i n t o h e a l t h y g r o u p(h e a l t h y r a t s w e r e r o u t i n e l y f e d),m o d e l g r o u p(m o d e l o f a l l e r g i c r h i n i t i s a s t h m a s y n d r o m e w a s e s t a b l i s h e d b y o v i n s e n s i t i z a t i o n a n d n a s a l d r i p a t t a c k),t r e a t m e n
9、 t g r o u p(m o d e l+i n t r a v e n o u s i n j e c t i o n o f L Y 2 9 4 0 0 2 0.5 m g/k g),a n d c o n-t r o l g r o u p(m o d e l+b u d e s o n i d e a e r o s o l).T h e e x p r e s s i o n o f T S L P w a s d e t e c t e d b y E L I S A a n d i mm u n o h i s t o c h e m i s t r y,S O D w a
10、s d e t e c t e d b y x a n t h i n e o x i d a s e,MD A w a s d e t e c t e d b y T B A,h i s t o p a t h o l o g i c a l c h a n g e s o f l u n g t i s s u e s w e r e o b-s e r v e d b y HE s t a i n i n g,t h e e x p r e s s i o n o f T R P V 1 w a s d e t e c t e d b y i mm u n o f l u o r e s
11、 c e n c e,a n d t h e e x p r e s s i o n s o f N F-B a n d I B w e r e d e t e c t e d b y w e s t e r n b l o t.R e s u l t s C o m p a r e d w i t h t h e h e a l t h y g r o u p,t h e r e w e r e a l o t o f i n f l a mm a t o r y c e l l s i n f i l t r a t i o n,b r o n c h i a l m u c o s a
12、e d e m a a n d t h i c k e n i n g,l u m e n n a r r o w i n g a n d m u c u s s e c r e t i o n i n c r e a s e d i n m o d e l g r o u p.C o m p a r e d w i t h m o d e l g r o u p,t h e p a t h o l o g i c a l c h a n g e s o f l u n g t i s s u e i n t r e a t m e n t g r o u p a n d c o n t r
13、o l g r o u p w e r e s i g n i f i-c a n t l y i m p r o v e d.C o m p a r e d w i t h t h e h e a l t h y g r o u p,T R P V 1,MD A,T S L P a n d N F-B w e r e i n c r e a s e d,w h i l e S O D a n d I B w e r e d e c r e a s e d i n t h e m o d e l g r o u p(P0.0 5).C o m p a r e d w i t h t h e m
14、 o d e l g r o u p,T R P V 1,MD A,T S L P a n d N F-B w e r e d e c r e a s e d i n t h e t r e a t m e n t g r o u p a n d t h e c o n t r o l g r o u p,w h i l e S O D a n d I B w e r e i n c r e a s e d(P0.0 5).C o n c l u s i o n B y i n h i b i t i n g T R P V 1,T S L P a n d MD A a n d p r o m
15、 o t i n g t h e e x p r e s s i o n o f S O D,t h e n e u r o g e n i c i n f l a mm a t i o n o f a i r w a y i n C A R A S r a t s i s r e d u c e d,t h e g e n e r a t i o n o f a i r w a y h y p e r r e a c t i v i t y i s p r e v e n t e d a n d t h e l e v e l o f o x i d a t i v e s t r e s
16、s i n j u r y a n d p a t h o l o g y i s i m p r o v e d,t h u s p l a y i n g a t h e r a p e u t i c r o l e.【K e y w o r d s】L Y 2 9 4 0 0 2;A l l e r g i c r h i n i t i s a s t h m a s y n d r o m e r a t s;O x y g e n f r e e r a d i c a l;T R P V 1;T S L P 过敏性鼻炎-哮喘综合征(C o m b i n e d a l l e
17、 r g i c r h i-n i t i s a n d a s t h m a s y n d r o m e,C A R A S)是一种变态反应性疾病,近年来发病率逐年增加1。磷酸酰肌醇-3激酶(P 1 3 K)被证实参与C A R A S的产生及发展2,因此抑制P I 3 K对C A R A S大鼠的治疗至关重要。瞬时感受器电位离子通道蛋白1(T r a n s i e n t R e c e p t o r P o-t e n t i a l V a n i l l o i d t y p e 1,T R P V 1)主要定位在神经纤维中,可受多种因素激活,其中神经炎性介质也可直接
18、或者间接激活T R P V 1。目前证实T R P V 1参与咳嗽、疼痛、炎症、肿瘤等的产生及发展3-6。目前已有多项研究证实T R P V 1在过敏性鼻炎中为高表达7-8,但具体作用机制暂未完全掌握。另外在C A R A S中炎性反应被认为是其产生及发展的重要因素之一。胸腺基质 淋 巴 生 成 素(T h y m i c s t r o m a l l y m p h o p o i e t i n,T S L P)是炎性反应的启动因素。相关炎性因子刺激上皮细胞分泌T S L P,通过促进树突细胞成熟诱导炎性因子的释放,最终导致淋巴细胞受到炎性因子浸润,加重哮喘炎性反应9。氧化应激是C A
19、R A S的病理机制之一,会造成D NA损伤,可激活核转录因子(N u c l e a r t r a n s c r i p t i o n f a c t o r-B,N F-B)等,活化炎性因子,加重气道炎性反应1 0。但目前关于T R P V 1、T S L P在C A R A S中作用的相关研究鲜少,具体机制尚不 明 确。因 此,本 文 旨 在 研 究P I 3 K抑 制 剂L Y 2 9 4 0 0 2对过敏性鼻炎-哮喘综合征大鼠氧自由基、T R P V 1神经元敏感性及T S L P表达的影响,现将结果报告如下。1 材料与方法1.1 实验动物 清洁级S D健康大鼠4 0只,购自苏
20、州市顾秀实验动物设备公司 生产许可证号:S C X K(苏)-2 0 1 9-0 1 2 4,体质量在2 0 03 0 0 g之间,鼠龄在6-8周,适应饲养1周后进行实验。本次实验已通过我院动物伦理委员会审批(批号:2 0 1 9 0 2 0 4)。1.2 主要实验试剂与仪器 B C A试剂盒(上海酶联生物公司),T S L P试剂盒(厦门仑昌硕生物科技有限公司),T S L P、N F-B、I B、T R P V 1一抗(南京森贝伽生物公司),苏木精染色液(厦门海标科技有限公司),辣根过氧化物酶二抗(上海李记生物科技有限公司),S O D、MD A试剂盒(上海铭博生物科技有限公司),枸橼酸盐
21、缓冲液(北京诺博莱德科技公司),凝胶成像仪(上海贺琛能源科技有限公司,型号:G e l S MA R T),酶标仪(青岛聚创环保集团有限公司,型号:J C-1 0 8 7 A)。1.3 L Y 2 9 4 0 0 2混悬液配置 取2 m g L Y 2 9 4 0 0 2粉末溶解于2 0 0 L的二甲基亚矾(DM S O)中,0.9%N a C l溶液定容至6 m L,震荡混匀。1.4 模型建立 根据文献1 1运用卵蛋白致敏和鼻部滴注攻击法建立过敏性鼻炎-哮喘大鼠模型:将卵白蛋白于大鼠腹腔注射2周后在连续鼻部滴注1周,建模。从初次致敏第7 d开始运用卵白蛋白滴鼻,1 0 L/1次/d,共7 d
22、。后隔日给予1 g/L卵白蛋白滴鼻,持续对鼻粘膜进行刺激。每隔7 d观察一次鼻部滴蛋白液3 0 m i n内搔鼻次数和喷嚏次数。记录大鼠鼻分泌物量、喷嚏次数及鼻痒程度。方法如下:鼻涕流至前鼻孔为1分;超过前鼻孔为2分;涕流满面为3分。喷嚏4个以内为1分;51 0个为2分;1 0个以上为3分。鼻痒轻度抓鼻为1分;频繁抓为2分;不停抓为3分。总分超过5分为动物造模成功。3 0只大鼠全部建模成功,均未发生死亡。1.5 分组及干预 4 0只大鼠随机分为健康组、模型组、治疗组、对照组,每组各1 0只。除正常组大鼠外,其余大鼠建立过敏性鼻炎-哮喘综合征模型。治疗组:大鼠静脉注射L Y 2 9 4 0 0
23、2(0.5 m g/k g),1次/周,共8周。对照组:大鼠给予布地奈德气雾剂(鲁南贝特制药有限公司)经鼻吸入治疗,2次/d,12吸/次,共8周。实验期间动物自由进食、饮水,模型组与正常组注射等量生理盐水。1.6 检测指标 1.6.1 E L I S A检测T S L P表达 治疗8周后,取5 m g左右 肺组织,离心5 m i n,1 5 0 0 r/m i n,取上 清。运 用E L I S A检测T S L P表达,实验步骤按照试剂盒说明进行。1.6.2 免疫组织化学法检测T S L P在肺组织中蛋白含量 治疗8周后,取各组大鼠5 m g肺组织石蜡切片,脱蜡、脱水后P B S清洗,将肺组
24、织切片浸染于3%过氧化氢溶液,约1 0 m i n;0.0 1 m o l/L P B S冲洗3次,加热至沸腾后自然冷却,P B S冲洗,封闭0.5 h,一抗滴加T S L P抗体(1 1 0 0稀释),4 孵育过夜;P B S(0.0 1 m o l/L)冲洗3次,1次/5 m i n,在室温下滴加稀释度为1 2 0 0的生物素化山羊抗兔I g G,孵育0.5 h,P B S(0.0 1 m o l/L)冲洗3次,1次/5 m i n,室温S A B C7721西部医学 2 0 2 3年9月 第3 5卷第9期 M e d J W e s t C h i n a,S e p t e m b e
25、 r 2 0 2 3,V o l.3 5,N o.9试剂浸染1 h;P B S(0.0 1 m o l/L)冲洗2次,1次/5 m i n,D A B显色,蒸馏水终止,乙醇脱水,二甲苯浸染1 0 m i n(2次),中性树胶封片,显微镜下观察,用I m-a g e P r o P l u s 6.0软件进行图片分析。1.6.3 检测各组大鼠氧自由基相关指标表达 治疗8周后,取各组大鼠5 m g肺组织剪碎,裂解液裂解,匀浆机匀浆制成1 0%悬液,离心5 m i n,1 2 5 0 r/m i n,后取血清。格按照说明书进行,黄嘌呤氧化酶法检测S O D,T B A法检测MD A。1.6.4 HE
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