YFV17D非感染性报告复制子及假病毒包装系统的建立.pdf
《YFV17D非感染性报告复制子及假病毒包装系统的建立.pdf》由会员分享,可在线阅读,更多相关《YFV17D非感染性报告复制子及假病毒包装系统的建立.pdf(8页珍藏版)》请在咨信网上搜索。
1、技术与方法生物技术通报BIOTECHNOLOGY BULLETIN2023,39(8):165-172收稿日期:2022-11-15基金项目:四川省科技国际科技创新合作(2022YFH0026),中国-中东欧国家联合教育项目(2021092)作者简介:何宇航,男,硕士研究生,研究方向:禽病病原学;E-mail:通讯作者:陈舜,女,教授,研究方向:禽分子病毒学和致病机制;E-mail:YFV17D 非感染性报告复制子及假病毒包装系统的建立何宇航1,2 胡涛1,2 吴震1,2,3 贺煜1,2,3 程安春1,2,3 陈舜1,2,3(1.四川农业大学动物医学院禽病防治研究中心,成都 611130 ;2
2、.四川农业大学动物医学院预防兽医研究所,成都 611130;3.动物疫病与人类健康四川省重点实验室,成都 611130)摘 要:构建 YFV17D 非感染性复制子及假病毒包装系统,旨在进一步解析黄热病毒的复制、组装分子机制。该研究利用反向遗传学技术,将基于 SP6 启动子的单拷贝 YFV17D 报告复制子改造成由 CMV 启动子驱动的低拷贝 YFV17D 报告复制子,同时将表达 YFV17D 结构蛋白的包装质粒与复制子质粒共同转染 BHK-21 细胞而建立 YFV17D 的反式假病毒包装系统。通过检测NanoLuc 萤光素酶活性(Nluc)、oxGFP 和 mCherry 荧光蛋白表达、间接免
3、疫荧光实验监测病毒双链 RNA 来确定复制子在 BHK-21细胞中复制情况和包装效果。结果表明,与复制缺陷型复制子相比,野生型复制子转染至 BHK-21 细胞中,随着转染时间的增加,Nluc 活性、oxGFP 和 mCherry 荧光蛋白表达也随之增加,同时 dsRNA 也随时间延长而增多。将复制子质粒和包装质粒共同转染至BHK-21 细胞后,收集上清再次感染 BHK-21 细胞,随后通过检测 Nluc 活性和 oxGFP 与 mCherry 蛋白的表达而确定假病毒包装成功。综上,成功构建了携带不同报告基因的 YFV17D 复制子,用于监控病毒基因组 RNA 的复制;成功搭建由包装质粒提供的结
4、构蛋白,将不具备感染性的 YFV17D 亚基因复制子打包成具有单轮感染能力的 YFV17D 假病毒系统。关键词:YFV17D 报告复制子;反向遗传学;反式互补;单轮感染病毒颗粒DOI:10.13560/ki.biotech.bull.1985.2022-1402Establishment of YFV17D Non-infectious Reporter Replicon and Pseudovirus Packaging SystemHE Yu-hang1,2 HU Tao1,2 WU Zhen1,2,3 HE Yu1,2,3 CHENG An-chun1,2,3 CHEN Shun1,2,
5、3(1.Research Center of Avian Diseases,College of Veterinary Medicine,Sichuan Agricultural University,Chengdu 611130;2.Institute of Preventive Veterinary Medicine,College of Veterinary Medicine,Sichuan Agricultural University,Chengdu 611130;3.Key Laboratory of Animal Diseases and Human Health of Sich
6、uan Province,Chengdu 611130)Abstract:The YFV17D noninfectious replicon and pseudovirus packaging system was constructed to further elucidate the molecular mechanism of replication and assembly of yellow fever virus.In this study,the single-copy YFV17D reporter replicon based on the SP6 promoter was
7、transformed into a low-copy YFV17D reporter replicon driven by the CMV promoter using reverse genetics.At the same time,the packaging plasmid expressing YFV17D structural protein and reporter replicon plasmid were co-transfected into BHK-21 cells to establish a YFV17D trans-pseudovirus packaging sys
8、tem.NanoLuc luciferase activity(Nluc),oxGFP and mCherry fluorescent protein expression,and indirect immunofluorescence assay were used to monitor viral double-stranded RNA to determine the replication and packaging effect of replicon in BHK-21 cells.The results showed that Nluc activity,oxGFP and mC
9、herry fluorescent protein expression increased steadily in wild-type replicon compared with replication-deficient replicon,while dsRNA also increased.After co-transfection of the replicon plasmids and packaging plasmids into BHK-21 cells,the supernatant was collected to re-infect BHK-21 cells.The su
10、ccess of pseudovirus packaging was confirmed by detecting Nluc activity and oxGFP and mCherry protein expression.In conclusion,the YFV17D replicon carrying different reporter genes was successfully constructed in this study to monitor the replication of viral genomic RNA.The structural proteins prov
11、ided by the packaging plasmid can successfully package the non-infectious YFV17D subgene replicons into a YFV17D pseudovirus system with single round infection ability.Key words:YFV17D reporter replicon;reverse genetics;trans-complementation;single-round infection virions生物技术通报 Biotechnology Bulleti
12、n2023,Vol.39,No.8166黄热病毒(yellow fever virus,YFV)属于黄病毒科(Flavivirdae)黄病毒属(Flavivirus),该类属成员还包括昆津病毒(Kunjin virus,KUNV)、坦布苏病毒(Tembusu virus,TMUV)、登革热病毒(Dengue virus,DENV)和日本脑炎病毒等。与其他黄病毒属成员一样,YFV 为单股正链 RNA 病毒,基因组全长 11 kb 左右,拥有一个开放阅读框(open reading frame,ORF)。ORF 编码一个多聚蛋白,包括 3 种结构蛋白:衣壳蛋白(capsid protein,C p
13、rotein)、前膜蛋白(premembrane,prM protein)和囊膜蛋白(envelope protein,E protein),以及7个非结构蛋白(non-structural protein):NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和 NS5。在 ORF 两侧为两个高度结构化的非编码区(untranslated region,UTR)5 UTR 和 3 UTR,包含病毒 RNA 合成以及影响病毒翻译和复制所必要的顺式作用元件1。YFV 有两种野生毒株,包括 Asibi毒株和法国噬内脏病毒,其中 YFV17D 是由 Asibi 毒株在猴子、小鼠和鸡细胞培养物中进行
14、了 176 次传代而来,其保留了病毒的免疫原性,失去了噬内脏性、噬神经性毒性和在蚊子体内传播能力2-4。亚基因复制子系统作为反向遗传学的重要组成部分,与感染性克隆一样能作为研究病毒强有力的工具。黄病毒亚基因复制子是保留了全部的非结构蛋白和非编码区的顺式作用元件,删除了部分结构蛋白基因的一种缺陷型基因组,它能够在宿主细胞内自行完成翻译和复制5。将报告基因引入以代替缺失的结构蛋白基因区域,并通过对报告基因表达的蛋白进行检测,可以更加容易监测亚基因复制子在细胞中的复制情况6-8。在复制子基础上,通过携带编码病毒结构蛋白(C、prM、E)的重组质粒来提供缺失的结构蛋白,与可以自我复制的病毒亚基因组产生
15、打包复制子基因组的假病毒颗粒,其在结构上近似于野生型病毒,具有与野生病毒相似的进入、翻译和复制的过程9-11。但由于这种病毒样颗粒所包含的基因仍然缺乏必需的结构蛋白基因,无法再次包装成成熟的病毒颗粒,故而这种病毒样颗粒无法从宿主细胞中释放启动新一轮的感染,因此称之为单轮感染病毒颗粒(single round infectious virus particles,SRIPs)12。这种通过反式包装出的SRIPs 已经在 TMUV、DENV、KUNV 和寨卡病毒上实现应用13-16。本研究利用反向遗传学技术成功分别构建携带 3 种 不 同 报 告 基 因(Nluc、oxGFP 和 mCherry)
16、的 YFV17D 复制子。通过检测 Nluc 萤光素酶蛋白、oxGFP 和 mCherry 荧光蛋白在细胞中的表达和对病毒双链 RNA(double strand RNA,dsRNA)染色观察,监控 YFV17D 复制子在 BHK-21 细胞中翻译和复制。将表达结构蛋白的包装质粒(pcDNA3.1-C28prME 和pcDNA3.1-CprME)与复制子共同转染至 BHK-21 细胞中,收集上清再次感染 BHK-21 细胞,通过检测细胞内的 Nluc 活性和 oxGFP、mCherry 蛋白表达来监控 SRIPs 的产生而成功建立 YFV17D 的假病毒包装系统。构建携带报告基因的 YFV17
17、D 复制子,可以帮助深入了解 YFV 基因组翻译和复制的调控机制。同时,基于复制子的 SRIPs系统为研究病毒吸附、进入和组装,以及病毒与宿主相互作用提供了有力的工具。1 材料与方法1.1 材料乳仓鼠肾细胞 BHK-21 由本实验室保存、携带报告基因的单拷贝 pCC1-YFV17D-rep 复制子质粒(爱沙尼亚塔尔图大学 Andrews Merits 教授惠赠)、大肠杆菌感受态细胞 DH5、Sure 菌株、低拷贝质粒pACYC177 和真核表达质粒 pcDNA3.1 均由本实验室保存;高保真 KOD OneTM PCR Master Mix 购于东洋纺生物科技有限公司;限制性内切酶购于 NEB
18、 公司;同源重组酶购于莫纳生物科技有限公司;核酸脂质体转染试剂购于翌圣生物科技股份有限公司;NanoLuc 萤光素酶检测试剂盒购于 Promega 公司;鼠抗 dsRNA J2 抗体购于 SCICONS 公司;FITC 荧光和TRITC 荧光标记羊抗鼠 lgG 购于 Abcam 公司;DAPI购于北京酷来搏科技有限公司。1.2 方法1.2.1 报告复制子和包装质粒构建 使用重叠延伸 PCR 技术和同源重组策略来构建 YFV17D 报告复制子。在 pACYC177 载体中选择 2 个限制性内切酶位点 SgrA I 和 BstE II,在 YFV17D 复制子基因组中选择 Kpn I、Nhe I
19、和 Xho I 3 个限制性内切酶位点,用于之后的酶切连接。使用 TMUV 感2023,39(8)167何宇航等:YFV17D 非感染性报告复制子及假病毒包装系统的建立染 性 克 隆 质 粒 pACNR CQW1-intron 扩 增 巨 细 胞病毒(Cytomegalovirus,CMV)启动子、丁型肝炎核酶(Hepatitis D ribozyme,HDVr)和猴空泡病毒40(Simian virus 40,SV40)多 聚 腺 苷 酸(polyade-nylation,poly)尾 信 号 序 列。将 CMV 与“5 UTR-Kpn I”片段融合成 P1 片段,其中 P1 片段覆盖“Sg
20、rAI-CMV-5 UTR-Kpn I”之间的基因序列;片段 P2 覆盖“Kpn I-Nhe I”之间的基因序列;片段P3 覆盖“Nhe I-Xho I”之间的基因序列;将 HDVr和 SV40 poly(A)与“Xho I-3 UTR”融 合 成 完整 P4 片段,覆盖“Xho I-BstE II”之间的基因序 列。接着,将 P1 片段与线性化的 pACYC177 载体同源重组,形成 P1 片段的亚克隆质粒 pACYC-P1,随后利用 Kpn I、Nhe I 和 Xho I 限制性内切酶将 P1-P4全部片段按顺序连接在 pACYC177 载体上,最终完成带有 3 种不同报告基因的 YFV1
21、7D 复制子质粒的构建,分别命名为:pACYC-YFV17D-Nluc-rep、pA-CYC-YFV17D-mCherry-rep 和 pACYC-YFV17D-oxG-FP-rep 以 及 pACYC-YFV17D-Nluc-rep-GDD、pAC-YC-YFV17D-mCherry-rep-GDD-AAA 和 pACYC-YFV17D-oxGFP-rep-GDD-AAA。包装质粒 pcDNA3.1-CprME 质粒由上海生工生 物 工 程 有 限 公 司 合 成。pcDNA3.1-C28prME 以pcDNA3.1-CprME 质粒为模板,保留 C 蛋白末端 28个氨基酸,扩增 C28pr
22、ME 基因,与经过 Hind III 和ApI I 限制性内切酶酶切后的 pCDNA3.1(+)线性载体连接。1.2.2 报告复制子和包装系统的工作验证 将 BHK-21 细胞接种至 24 孔板,待细胞达到 70%-90%汇合度时,按照翌圣核酸脂质体转染试剂说明书转染YFV17D 报告复制子,转染 6 h 后更换含 1%胎牛血清的培养基,然后在 37,5%CO2 的培养箱中继续培养。YFV17D 报告复制子和包装质粒共同转染至接种 BHK-21 细胞的 6 孔板中,转染后 6 h 更换培养基继续培养 48 h,收集上清。将 BHK-21 细胞接种至24 孔板,待细胞长到 70%左右密度,弃去培
23、养基,将收集的上清滴加至每孔中,孵育 48 h 后检测。1.2.3 NanoLuc 萤光素酶活性的检测 使用 NanoLuc萤光素酶检测试剂盒,收集转染 YFV17D-Nanoluc-rep 后不同时间点的 BHK-21 细胞和孵育含 SRIPs 上清的 BHK-21 细胞。使用 Glo Lysis Buffer 裂解 BHK-21 细胞,添加至 96 孔板中,Nano-Glo 底物和 Nano-Glo assay buffer 按 149 比例混合获得 Nano Glo 反应物,与 96 孔板中细胞裂解样品混合,在微孔板发光检测仪中检测样品。1.2.4 荧光蛋白的检测 从 24 孔板中收集转
24、染YFV17D-oxGFP-rep、YFV17D-mCherry-rep 后 不 同时间点的细胞爬片和孵育含 SRIPs 上清的 BHK-21细胞爬片。收集的爬片使用 4%多聚甲醛固定,经PBST 洗涤后,使用 0.25%Triton-PBS 在 4透化 1 h,PBST 洗涤;细胞核经 DAPI 复染;最后滴加甘油封片,置于荧光显微镜下观察。1.2.5 间接免疫荧光试验(indirect immunofluores-cence assay,IFA)从 24 孔板中收集转染 3 种报告复制子质粒的不同时间点的细胞爬片。爬片使用 4%多聚甲醛固定,经 PBST 洗涤后,使用 0.25%Tri-t
25、on-PBS 在 4透化 1 h,PBST 洗涤;加入 5%BSA在 37封闭 1 h,使用 PBST 洗涤;用鼠抗 dsRNA J2 抗体作为一抗,分别以 FITC 荧光标记羊抗鼠 lgG和 TRITC 荧光标记羊抗鼠 lgG 作为二抗孵育,细胞核使用 DAPI 复染;最后滴加甘油封片,置于荧光显微镜下观察。2 结果2.1 YFV17D报告复制子的构建以分别携带 NanoLuc、mCherry、oxGFP 报告基因的 YFV17D 复制子 pCC1-YFV17D-rep 为模板。在实验室现有质粒 pACYC177 的基础上,通过 SgrA II和 BstE II 限制性内切酶酶切,获得 pA
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- YFV17D 感染性 报告 复制子 病毒 包装 系统 建立
1、咨信平台为文档C2C交易模式,即用户上传的文档直接被用户下载,收益归上传人(含作者)所有;本站仅是提供信息存储空间和展示预览,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对上载内容不做任何修改或编辑。所展示的作品文档包括内容和图片全部来源于网络用户和作者上传投稿,我们不确定上传用户享有完全著作权,根据《信息网络传播权保护条例》,如果侵犯了您的版权、权益或隐私,请联系我们,核实后会尽快下架及时删除,并可随时和客服了解处理情况,尊重保护知识产权我们共同努力。
2、文档的总页数、文档格式和文档大小以系统显示为准(内容中显示的页数不一定正确),网站客服只以系统显示的页数、文件格式、文档大小作为仲裁依据,平台无法对文档的真实性、完整性、权威性、准确性、专业性及其观点立场做任何保证或承诺,下载前须认真查看,确认无误后再购买,务必慎重购买;若有违法违纪将进行移交司法处理,若涉侵权平台将进行基本处罚并下架。
3、本站所有内容均由用户上传,付费前请自行鉴别,如您付费,意味着您已接受本站规则且自行承担风险,本站不进行额外附加服务,虚拟产品一经售出概不退款(未进行购买下载可退充值款),文档一经付费(服务费)、不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
4、如你看到网页展示的文档有www.zixin.com.cn水印,是因预览和防盗链等技术需要对页面进行转换压缩成图而已,我们并不对上传的文档进行任何编辑或修改,文档下载后都不会有水印标识(原文档上传前个别存留的除外),下载后原文更清晰;试题试卷类文档,如果标题没有明确说明有答案则都视为没有答案,请知晓;PPT和DOC文档可被视为“模板”,允许上传人保留章节、目录结构的情况下删减部份的内容;PDF文档不管是原文档转换或图片扫描而得,本站不作要求视为允许,下载前自行私信或留言给上传者【自信****多点】。
5、本文档所展示的图片、画像、字体、音乐的版权可能需版权方额外授权,请谨慎使用;网站提供的党政主题相关内容(国旗、国徽、党徽--等)目的在于配合国家政策宣传,仅限个人学习分享使用,禁止用于任何广告和商用目的。
6、文档遇到问题,请及时私信或留言给本站上传会员【自信****多点】,需本站解决可联系【 微信客服】、【 QQ客服】,若有其他问题请点击或扫码反馈【 服务填表】;文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“【 版权申诉】”(推荐),意见反馈和侵权处理邮箱:1219186828@qq.com;也可以拔打客服电话:4008-655-100;投诉/维权电话:4009-655-100。