ARHGAP21通过失活WNT信号通路抑制非小细胞肺癌中的上皮间质转化.pdf
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1、肺癌是全球公共卫生领域面临的一项严重挑战。它在肿瘤发病率排名第二,死亡率位居第一 1。其中非小细胞肺癌(NSCLC)是最常见的肺癌类型,占所有病例的80%85%2,3。近年来肺癌在分子生物学领域的重要突破,尤其是在基因和表观遗传学的研究中,为我们理解它的发生机制、改善诊断手段和研发新型靶向、免疫治疗策略提供了新的可能。此外,还可能通过寻找新的肿瘤标志物,帮助我们提高肺癌的早期诊断能力 4-6。ARHARHGAPGAP2121通过失活通过失活WNTWNT信号通路抑制非小细胞肺癌中的上信号通路抑制非小细胞肺癌中的上皮间皮间质转化质转化谢紫平1,刘立威2,房锦存2,钟星怡1,林俊豪1,陈逢生11南方
2、医科大学中西医结合医院,广东 广州 510315;2南方医科大学附属何贤纪念医院,广东 广州 511400ARHGAP21inhibitsepithelial-mesenchymaltransitionbyinactivatingtheWNTsignaling pathway in non-small cell lung cancerXIE Ziping1,LIU Liwei2,FANG Jincun2,ZHONG Xingyi1,LIN Junhao1,CHEN Fengsheng11Cancer Center,Integrated Hospital of Traditional Chine
3、se Medicine,Southern Medical University,Guangzhou 510315,China;2HexianMemorial Hospital Affiliated to Southern Medical University,Guangzhou 511400,China摘要:目的 探究Rho GTPase激活蛋白21(ARHGAP21)对非小细胞肺癌(NSCLC)细胞迁移、转移的影响并探讨其作用机制。方法 通过TCGA、CPTAC数据库和临床资料确定ARHGAP21在NSCLC中的表达与患者预后的关系;通过免疫印迹(Westernblot)和免疫组化验证ARH
4、GAP21在NSCLC的基础表达;通过慢病毒稳转构建敲低ARHGAP21的NSCLC细胞系;通过Transwell实验和划痕愈合实验检测敲低ARHGAP21对肺癌细胞体外迁移能力的影响;通过裸鼠肺转移肿瘤模型的构建检测敲低ARHGAP21对肿瘤细胞体内转移能力的影响;通过生物信息学分析预测ARHGAP21的可能作用机制;通过Western blot实验验证其相关机制。结果 ARHGAP21的低表达与不良预后相关(P0.05);与正常组织相比,ARHGAP21在肺癌组织中表达下调(P0.001);Transwell和划痕愈合实验结果显示敲低ARHGAP21促进了肺癌细胞迁移能力(P0.001)。
5、裸鼠尾静脉肺转移模型结果显示与阴性对照组相比,敲低ARHGAP21组肺部肿瘤转移结节数量更多(P0.05)且具有更高表达水平的N-钙粘蛋白和波形蛋白。生物信息学分析表明,APC、GSK3、Axin和ARHGAP21之间存在高度相关性(P0.001)。Western blot结果显示敲低ARHGAP21能够降低-catenin的泛素化,上调N-钙黏蛋白并激活WNT信号通路。结论 ARHGAP21的下调能够显著促进NSCLC的迁移、转移能力,这可能与ARHGAP21基因下调后激活WNT信号通路,影响APC、GSK3、Axin的表达从而降低-catenin的泛素化有关。关键词:ARHGAP21基因;
6、上皮间质转化;WNT信号通路;非小细胞肺癌Abstract:Objective To investigate the role of Rho GTPase-activating protein 21(ARHGAP21)in regulating the migration andmetastasis of non-small cell lung cancer(NSCLC)cells.Methods TCGA,CPTAC database were used to analyze the correlationof ARHGAP21 expression level in NSCLC and t
7、he patients prognosis.The expression of ARHGAP21 in clinical specimens ofNSCLC tissues was examined using Western blotting and immunohistochemistry.The effect of ARHGAP21 knockdown onmigration ability of lung cancer cell lines was examined using Transwell assay and wound healing assay.A nude mouse m
8、odelwith injection of lung cancer H1299 cells via the tail vein was used to examine the effect of ARHGAP21 knockdown on themetastatic ability of the tumor cells.The possible mechanism of ARHGAP21 was predicted by bioinformatics analysis andverified using Western blotting.Results A low ARHGAP21 expre
9、ssion was associated with poor prognosis of patients withNSCLC(P0.05).ARHGAP21 expression was significantly downregulated in lung cancer tissues as compared with theadjacent tissues(P0.001).In cultured lung cancer cells,ARHGAP21 knockdown obviously promoted the migration ability ofthe cells(P0.001).
10、In the nude mouse models,injection of H1299 cells with ARHGAP21 knockdown,as compared with thenegative control cells,resulted in a greater number of metastatic lung cancer nodules(P0.05),which expressed higher levelsof N-cadherin and vimentin.Bioinformatic analysis showed a close correlation of ARHG
11、AP21 with APC,GSK3,and Axin(P0.001).Western blotting showed that ARHGAP21 knockdown significantly decreased ubiquitination of-catenin,upregulatedN-cadherin and activated the WNT signaling pathway in the lung cancer cells.Conclusion ARHGAP21 downregulation cansignificantly promote the migration and m
12、etastatic ability of NSCLC possibly as a result of WNT signaling pathway activation,which reduces the ubiquitination of-catenin by affecting the expressions of APC,GSK3,and Axin.Keywords:Rho GTPase-activating protein 21;epithelial-mesenchymal transition;WNT signaling pathway;non-small cell lungcance
13、r收稿日期:2023-05-7基金项目:国家自然科学基金(81872251);广东省自然科学基金(2020A1515010093,2021A1515012104);南方医科大学中西医结合医院院长基金(1202102002)Supported by National Natural Science Foundation of China(81872251).作者简介:谢紫平,在读硕士研究生,E-mail:xzp-;刘立威,主治医师,E-mail:。谢紫平、刘立威共同为第一作者通信作者:陈逢生,副主任医师,硕士生导师,E-mail:;林俊豪,医师,E-mail:l_i_doi 10.12122/j
14、.issn.1673-4254.2023.08.08J South Med Univ,2023,43(8):1322-13321322这种现代化精准医学的治疗方式,正在改变我们对肺癌的认识和治疗策略,也能为患者带来更大的希望。RhoGTPases是Ras超家族的一个亚家族,它们在细胞骨架、细胞黏附和迁移等多种生物学过程中发挥至关重要的作用 7-9。ARHGAP21是一种RhoGTPase激活蛋白,它通过加速RhoGTPase的GTP水解,负性调节RhoGTPase的活性 10。ARHGAP21被报道参与调控多种肿瘤。Carles等 11 研究表明,ARHGAP21在头颈鳞癌中高表达。Bigar
15、ella等 12 发现在胶质母细胞瘤中,ARHGAP21与FAK相互作用以抑制细胞迁移和侵袭。Lazarini等 13 发现,缺乏ARHGAP21可以促进前列腺癌细胞迁移并减少细胞增殖。现有关于ARHGAP21的研究主要集中在细胞骨架重组和内质网动态性方面的作用。然而,这些研究并未全面揭示ARHGAP21在生物体内的具体功能。尤其是在肺癌中,尚未有人深入研究。因此,ARHGAP21在肺癌中发挥的生物功能仍需进一步探索。另一方面,尽管有研究报道ARHGAP21在一些肿瘤中可能起抑癌因子的作用,但其在肺癌迁移和转移的确切机制尚不清楚。我们通过生物信息学分析首次关注到ARHGAP21与破坏复合物之间
16、的关系。这一发现为我们提供了一种全新的角度,有助于更深入地理解ARHGAP21,特别是其在NSCLC的作用机制,也可能为肺癌的治疗提供新的靶点,具有重要的研究意义。1 材料和方法1.1 材料肺癌细胞系 A549、H1299、PC-9、H1975、H322、H460和人支气管上皮细胞系(16HBE)均来自南方医科大学。肺癌组织芯片(HLugA180Su04,上海芯超),并得到伦理审查委员会的批准(YB M-05-02)。35周龄的BALB/c裸鼠(雌性,谨为生物)。动物研究由南方医科大学中西医结合医院伦理委员会审查和批准(伦理审批号:2022-070)。DMEM、RPMI 1640培养基、胎牛血
17、清(Gibco);Lipofectamine 3000(赛默飞);细胞总RNA提取试剂盒(福际生物);TB Green Premix Ex Taq II 试剂盒、Prime Script RT试剂盒(宝日医生物);10%凝胶试剂盒(雅酶);免疫组化检测试剂盒(PV9000,中杉金桥);肺癌组织芯片(HLugA180Su04,芯超生物)。1.2 方法1.2.1 细胞培养肺癌细胞系 A549、H1299、PC-9、H1975、H322、H460和人支气管上皮细胞系(16HBE)均在含有10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中培养,所有细胞均在37 和5%CO2的恒温培养箱中培养。定期观察细胞状态
18、、更换新鲜培养基、当细胞融合度达到80%左右,对细胞进行传代操作。1.2.2 细 胞 转 染 接 种 合 适 数 量 的 细 胞,使 用Lipofectamine 3000进行细胞转染,转染24 h后使用实时定量PCR检测ARHGAP21的表达水平。1.2.3 ARHGAP21敲低表达细胞株的构建 使用上海和元生物科技有限公司设计包装的敲低ARHGAP21慢病毒和空载体慢病毒,进行细胞转染。使用含有2mg/mL嘌呤霉素的培养基筛选稳转细胞。病毒含有荧光素酶和绿色荧光蛋白,可用于观察动物实验中肺转移瘤的情况。1.2.4 RT-qPCR 使用细胞总RNA提取试剂盒提取总RNA,随后使用Prime
19、Script RT试剂盒对RNA样本进行逆转录。最后使用TB Green Premix Ex Taq II 试剂盒在Light Cycler 480 II系统上进行实时定量PCR。使用2-Ct方法计算相对表达水平。引物序列如表1所示。1.2.5 Western blot检测 蛋白质样本用十二烷基硫酸钠(SDS)处理后存储在-80 冰箱中。使用10%凝胶试剂盒进行电泳,并使用BIO-RAD转膜机将样品转移到聚偏氟乙烯膜上。使用5%脱脂奶粉封闭膜,并根据分子大小裁成适当的条带。在4 的环境下,将条带置于摇床振荡过夜孵育12 h。随后使用相应的二抗孵育条带。最后向条带中加入增强型化学发光试剂,并使用
20、MiniChemi化学发光成像与分析系统显影条带。本文使用的抗体包括anti-ARHGAP21(22183-1-AP)、anti-N-cadherin(66219-1-Ig)、anti-GAPDH(10494-1-AP)、Anti-Ubiquitin(10201-2-AP)和anti-Catenin(51067-2-AP)(武汉三鹰);anti-GSK3(A6164)、anti-AXIN1(A16019)抗体(爱博泰克生物);Anti-APC(2504S,CST)。1.2.6 Transwell实验检测细胞迁移 取1105个细胞,接种在上室中,上室底部为8 m孔径的膜。往上室加入PrimerF
21、:-actinR:-actinF:ARHGAP21R:ARHGAP21F:Gsk3R:Gsk3F:AxinR:AxinF:APCR:APCF:-cateninR:-cateninF:GAPDHR:GAPDHSequence(5-3)CATGTACGTTGCTATCCAGGCCTCCTTAATGTCACGCACGATCATGGCACAGCCAGTTGAAATCCCTACCAGGTTGTGTCAGTAGGCAGCATGAAAGTTAGCAGAGGCGACCAGTTCTCCTGAATCGACCTGGGGTATGAGCCTGAGGCTTATCCCATCTTGGTCATCAAAATGTCCCTCCGTT
22、CTTATGGCTGAAGTTGAGCGTAATACCAGTAAAGCGGCTGTTAGTCACTGGCGAGTCATTGCATACTGTCCATCAATGACCCCTTCATTGACCGACAAGCTTCCCGTTCTCAG表1 本研究所使用的引物序列Tab.1 Primersequencesusedinthisstudyhttp:/www.j-J South Med Univ,2023,43(8):1322-13321323适量无血清培养基,往下室加入适量含10%胎牛血清的RPMI 1640。于37、5%CO2的条件下孵育8 h,等待细胞通过上室的孔隙迁移至下室。使用4%的多聚甲醛对细胞进
23、行固定。使用结晶紫对细胞染色,最后通过显微镜观察迁移的细胞数量.1.2.7 划痕实验检测细胞迁移 首先在六孔板中接种适当数量的细胞,等待细胞生长覆盖整个培养皿,然后使用无酶的移液枪头在细胞皿上水平竖直划若干条直线,最后观察和分别拍摄0、24、48和72 h后划痕处的缺口愈合情况。1.2.8 裸鼠模型构建 选择35周龄的BALB/c裸鼠(雌性)。将H1299-shNC、H1299-shARHGAP21细胞通过尾静脉分别注射到对照组与实验组的裸鼠体内,构建体内异种移植转移模型(6只/组,注射细胞2.5106/只)。在肿瘤细胞注射后的第5周,通过腹腔注射荧光素钠盐(150 mg/kg)在活体成像仪中
24、检测裸鼠肿瘤的生长情况。随后,将裸鼠处死,收集肺组织并在荧光镜下拍照。最后,将裸鼠肺组织固定在4%的多聚甲醛中,进行石蜡包埋,并切成3m厚的切片。1.2.9 免疫共沉淀和蛋白泛素水平检测 取1107细胞并用含磷酸酶和蛋白酶抑制剂的IP裂解缓冲液裂解。收集细胞裂解物的上清液并与抗-catenin抗体或正常兔IgG抗体在摇床上于4 下孵育24 h。磁珠用洗涤缓冲液洗涤两次,随后与蛋白质抗体混合物一同置于室温条件下的摇床上孵育30 min。将混合物用磁珠分离并用洗涤缓冲液清洗4次。将清洗后的磁珠沉淀物加入30 LSDS,并在95 下变性10 min。收集磁珠分离后的上清液。待后续进行Western
25、blot检测,使用抗泛素抗体来检测IP样品的泛素化水平。1.2.10 免疫组织化学染色 使用免疫组化检测试剂盒进行肺癌组织芯片的染色,经过脱蜡、抗原修复的操作随后阻断内源性过氧化物酶、孵育一抗、孵育反应增强液、孵育酶标二抗,最后使用DAB显色。芯片染色结果评分6分的评分分别表示低表达和高表达。1.3 统计学分析每个体外实验至少进行了3次独立的重复试验。结果以均数标准差表示。使用独立样本t检验进行组间分析。采用Kaplan-Meier生存分析以OS,PFS和DFS为观测指标。使用Fisher精确检验评估ARHGAP21表达与临床病理特征之间的关系。所有统计分析均使用GraphPad Prism6
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