乌头汤对膝骨关节炎大鼠软骨细胞焦亡相关基因表达的影响_金灵璐.pdf
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1、1 基础研究 风湿病与关节炎 2023 年 3 月 第 12 卷第 3 期 Rheumatism and Arthritis March 2023 Vol.12 No.3乌头汤对膝骨关节炎大鼠软骨细胞焦亡相关基因表达的影响金灵璐1,2,付长龙1,2,涂海水1,2,李莹莹1,2,郑志煌1,2,仲卫红3,4,李宇涛5【摘要】目的:探讨乌头汤通过调控软骨细胞炎性焦亡途径延缓膝骨关节炎软骨退变的作用与机制。方法:将 36 只 SD 大鼠(雄性,8 周龄)随机分为空白对照组、模型对照组和乌头汤组,每组 12 只。空白对照组不造模,模型对照组和乌头汤组采用改良 Hulth 法造模。空白对照组与模型对照组采
2、用生理盐水(3 mgkg-1d-1)灌胃,乌头汤组采用乌头汤(生药浓度 4.2 gmL-1)灌胃。干预 8 周后,麻醉状态下摘取大鼠膝关节软骨。采用 Western blot 检测不同组别关节软骨中核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白 3(NLRP3)、半胱氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)、白细胞介素(IL)-1、IL-18 的蛋白含量表达;采用Real-time PCR 检测不同组别关节软骨中 NLRP3、Caspase-1、IL-1、IL-18 的基因相对表达变化。结果:模型对照组和乌头汤组 NLRP3、Caspase-1、IL-1、IL-18 蛋白含量与基因相对表达量均上调,与空白对照组
3、比较,差异有统计学意义(P 0.01);乌头汤组能够下调 NLRP3、Caspase-1、IL-1、IL-18 蛋白含量与基因相对表达量,与模型对照组比较,差异有统计学意义(P 0.05)。结论:乌头汤可改善膝骨关节炎大鼠软骨 NLRP3、Caspase-1、IL-1、IL-18 的表达,抑制软骨细胞焦亡,延缓软骨退变。【关键词】膝骨关节炎;乌头汤;核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白 3;半胱氨酸蛋白酶-1;炎症因子;关节软骨;细胞焦亡;大鼠doi:10.3969/j.issn.2095-4174.2023.03.001Effect of Wutou Tang(乌 头 汤)on the Expr
4、ession of Chondrocyte Pyrosis Related Genes in Rats with Knee OsteoarthritisJIN Ling-lu,FU Chang-long,TU Hai-shui,LI Ying-ying,ZHENG Zhi-huang,ZHONG Wei-hong,LI Yu-tao【ABSTRACT】Objective:To explore the effect and mechanism of Wutou Tang(乌头汤)on delaying the cartilage degeneration of knee osteoarthrit
5、is by regulating the inflammatory pyrosis of chondrocytes.Methods:Thirty-six SD rats(male,eight weeks old)were randomly divided into a blank control group,a mod-el control group and a Wutou Tang group,12 rats in each group.Except the blank control group,the other groups were established models by mo
6、dified Hulth method.The blank control group and the model control group were gavaged with normal saline(3 mgkg-1d-1),while the Wutou Tang was gavaged with Wutou Tang(crude 基 金 项 目:福 建 省 自 然 科 学 基 金 项 目(2020J01736,2022J01374);福 建 省 卫 生 健 康 中 青 年 骨 干 人 才 培 养 项 目(2021GGA062)作者单位:1.福建中医药大学中西医结合研究院,福建 福州
7、 350122;2.福建省中西医结合老年性疾病重点实验室,福建 福州 350122;3.福建省康复技术重点实验室,福建 福州 350003;4.福建中医药大学附属康复医院,福建 福州 350003;5.福建中医药大学中医学院,福建 福州 350122通信作者:李宇涛 福建省福州市上街镇邱阳路 1 号,drug concentration 4.2 gmL-1).After 8 weeks of intervention,the rat knee joint cartilage was removed under anesthesia.Detection of protein content ex
8、pressions of NLRP3,Caspase-1,IL-1 and IL-18 of artic-ular cartilage was made in different groups by Western blot.Real-time PCR was used to detect the relative expressions of NLRP3,Caspase-1,IL-1 and IL-18 of articular car-2风湿病与关节炎 2023 年 3 月 第 12 卷第 3 期 Rheumatism and Arthritis March 2023 Vol.12 No.
9、3tilage in different groups.Results:The protein content and the relative expression of NLRP3,Caspase-1,IL-1 and IL-18 in the model control group and the Wutou Tang group were up-regulated,and the difference was statistically significant compared with the blank control group(P 0.01).In the Wutou Tang
10、 group,the protein content and the relative expression of NLRP3,Caspase-1,IL-1 and IL-18 can be down-regulated,and the difference was statis-tically significant compared with the model control group(P 0.05).Conclusion:Wutou Tang can improve the expressions of NLRP3,Caspase-1,IL-1 and IL-18 in cartil
11、age of knee osteoarthritis rats,inhibit chondrocyte pyro-sis and delay cartilage degeneration.【Keywords】knee osteoarthritis;Wutou Tang(乌头汤);NLRP3;Caspase-1;inflammatory factors;articu-lar cartilage;cell pyrosis;rats膝骨关节炎(knee osteoarthritis,KOA)是常见的慢性退行性骨关节疾病,以关节内部炎症与软骨磨损导致的疼痛、僵硬、活动受限为主要特征。关节软骨细胞正常生
12、理状态改变是导致软骨退变或损伤、发生炎性反应的重要原因1。目前,KOA 的发病率呈现逐年上升趋势,且致残率较高,给患者家庭和社会造成极大的负担,亟需寻找有效的治疗方法。乌头汤源于金匮要略,是治疗痹证的经方,由制川乌、麻黄、白芍、黄芪、炙甘草组成,功擅温阳通络、宣痹止痛,可用于治疗寒湿痹阻所致的肢体关节疼痛、屈伸功能障碍等,临床治疗KOA 效果显著,但作用机制尚不明确2。近年研究证实,细胞焦亡作为一种新型细胞程序性死亡方式,与 KOA 的转归密切相关。细胞焦亡发生后,可导致软骨周围炎症因子的释放增加,并加剧软骨的降解与退变3。半胱氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)介导细胞炎性焦亡经典通路,核苷
13、酸结合寡聚化结构域样受体蛋白 3(NLRP3)在 KOA 疾病发生过程中被激活,参与软骨病理代谢过程4。白细胞介素-1(IL-1)与 IL-18 是 NLRP3 经典下游炎症因子。因此,本研究从炎性焦亡途径,探究乌头汤对 KOA 大鼠软骨中 NLRP3、Caspase-1、IL-1、IL-18 表达的影响,探讨其参与软骨细胞炎性焦亡的作用机制,以期为临床乌头汤治疗 KOA 提供实验依据。1 实验材料1.1 实验动物SPF级雄性SD大鼠36只,2月龄,购于上海斯莱克实验动物有限责任公司,实验动物生产许可证号 SCXK(沪)2012-0002。饲养于福建中医药大学实验动物中心,实验动物使用许可证号
14、 SYXK(闽)2019-0001。自由进食,适宜温度,标准环境喂养。1.2 实验药物乌头汤药材由福建中医药大学附属第三人民医院药剂科提供,药物组成:制川乌6 g,麻黄、芍药、炙甘草、黄芪各 9 g。注射用青霉素钠 160 万单位(江西科达动物药业有限公司)。1.3 实验试剂及器材SDS-PAGE 凝胶制备试剂盒(批号 16J27C38,博士德生物工程有限公司);超敏 ECL 化学发光试剂盒(批号 082020201116,碧云天生物技术有限公司);GAPDH 兔源多克隆抗体(批号 00098110,武汉三鹰生物技术有限公司);山羊抗兔 IgG(H+L)(武汉三鹰生物技术有限公司);HRP c
15、onjugate(批号 20000258,武 汉 三 鹰 生 物 技 术 有 限 公 司);RNA isolat-er Total RNA Extraction Reagent 试 剂 盒(批 号7E490L0,诺唯赞生物技术有限公司);ChamQ SYBR qPCR Master Mix 试剂盒(批号 7E412L0,诺唯赞生物技术有限公司);HiScript Q RT SuperMix for qPCR(+g DNA wiper)试剂盒(批号 7E572G1,Vazyme);NLRP3、Caspase-1、IL-1、IL-18 引物(尚亚生物技术有限公司);凝胶成像系统(型号GELDOC2
16、000,美国Bio-Rad公司);PCR 仪(型号 C1000 Touch,美国 Bio-Rad 公司);荧光定量PCR仪(型号CFX96,美国Bio-Rad公司)。2 实验方法2.1 乌头汤制备纯水浸泡制川乌 30 min,先煎1 h,降低毒性;后加入其余药材共同煎煮 1 h,所得煎剂过滤制备浓缩剂(含生药量为4.2 gmL-1),室温冷却后,4 保存。2.2 分组及造模方法8周龄雄性SD大鼠36只,按照随机数字表法分为空白对照组 12 只和造模组24 只。适应性喂养 1 周后,采用改良 Hulth 法造模,3 风湿病与关节炎 2023 年 3 月 第 12 卷第 3 期 Rheumatis
17、m and Arthritis March 2023 Vol.12 No.3术前禁食 12 h,自由饮水。采用质量分数为 2%的戊巴比妥钠(默克医疗)腹腔注射麻醉,离断内侧副韧带与前交叉韧带,小心摘除内侧半月板,注意避免损伤软骨面。术后 160 万单位青霉素肌内注射给药预防感染,注意观察大鼠失血及伤口愈合状况。驱赶活动 0.5 hd-1,加重软骨磨损。观察大鼠活动步态异常及关节肿胀严重程度,关节直径增长,模型鼠状态符合实验要求,将造模组大鼠随机分为乌头汤组和模型对照组,每组 12 只。2.3 给药及取材动物在统一饲养条件中进行干预。空白对照组与模型对照组给予生理盐水(3 mgkg-1d-1)灌
18、胃,乌头汤组予乌头汤(生药浓度 4.2 gmL-1)灌胃,剂量变化参照大鼠平均体质量 10 mgkg-1d-1计算。每周 6 次,共计8 周。干预后摘取各组 SD 大鼠关节软骨,于液氮中保存。2.4 Western Blot 检测分组干预后的软骨研磨后从匀浆中提取蛋白。定量后用 SDS-PAGE 凝胶制备试剂盒电泳分离,转膜,封闭,4 环境中摇床震荡过夜。PVDF 膜使用 TBS-T 清洗并稀释二抗孵育,室温下孵育 1 h;化学发光液 1 1 避光配制,PVDF 膜置于成像仪中,均匀滴加显影液反应1 min,避光操作显影并分析。2.5 Real-time PCR 检测RNA 提取操作严格按照
19、RNA isolater Total RNA Extraction Reagent 试剂盒说明书进行,于通风柜中冰上操作。所用试剂对人体有害,注意安全防护。4 环境下离心机以 12000 rmin-1离心 20 min,离心半径 15 cm,离心后于管底部可见白色透明羽毛样片状 RNA,乙醇洗涤后 10 L DEPC 水溶解,分光光度计下检测 RNA 浓度,并将其调整到适宜浓度。逆转录操作严格按照 HiScript Q RT SuperMix for qPCR(+g DNA wiper)试剂盒说明书进行。各项引物合成序列见表 1。反应体系:ChamQ SYBR qPCR Master Mix
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