幽门螺杆菌及其毒力因子空泡...源重组修复和细胞周期的影响_莫慧.pdf
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1、基金项目:河南省科技英才海外研修工程项目()作者简介:莫慧(),女,硕士,住院医师,主要从事消化病学基础与临床研究。:通信作者:黄煌(),女,博士,副主任医师,主要从事消化病学基础与临床研究。:幽门螺杆菌及其毒力因子空泡细胞毒素 对人胃腺癌细胞 同源重组修复和细胞周期的影响莫 慧,黄 煌,梅 璐,米 阳,刘 斌,白利梅,于 泳,(郑州大学第五附属医院消化内科,河南 郑州;郑州大学马歇尔医学研究中心,河南 郑州;河南省幽门螺杆菌及微生态与消化道肿瘤重点实验室,河南 郑州)摘要 目的 研究幽门螺杆菌()标准株 和其毒力因子空泡细胞毒素()对人胃腺癌细胞 损伤、同源重组修复和细胞周期的影响。方法取对
2、数生长期的人胃腺癌 细胞,应用 标准株()和其 基因敲除株()以感染复数(,)分别感染 细胞,使用 方法检测 损伤标记蛋白、修复关键蛋白(、)、细胞周期检测点激酶()的表达水平,进一步用流式细胞术检测细胞周期,验证 及其毒力因子 对 修复和细胞周期的影响。结果 损伤标记蛋白 的表达,在 感染组较未感染组上调(:,;:,),在 感染组较 感染组下调(:,;:,)。、和 的表达在 感染 组较未感染组下调(:,;:,;:,;:,),而、的表达在 感染 组均较 感染 组上调(:,;:,)的表达在 感染 组较 感染 组上调(,)。进一步采用流式细胞术检测细胞周期发现 感染组 期细胞数较未感染组下调(,)
3、,期细胞数上调(,)。而 感染组 期细胞数较 感染组上调(,),期细胞数下调(,)。结论 标准株感染人胃腺癌细胞后引起 损伤,抑制了细胞 修复,并引起细胞周期阻滞,其中 毒力因子起到了重要作用。关键词 幽门螺杆菌;同源重组修复;胃腺癌;空泡细胞毒素:中图分类号 文献标识码 文章编号 (),(,;,;,)()(),()()()(),(,),()肿瘤基础与临床 年 月第 卷第 期 (:,;:,)(:,;:,),(:,;:,;:,;:,)(:,;:,)(,),(,),(,)(,),(,),;胃癌是全球发病率第 位和死亡率第 位的恶性肿瘤。在胃癌的发生、发展过程中,幽门螺杆菌(,)感染引起的胃炎及癌前
4、病变起重要作用。是一种寄生于胃黏膜上皮细胞内的革兰氏阴性微需氧菌,其长期慢性感染胃黏膜上皮细胞是引起胃癌发生发展的重要危险因素。感染会导致胃癌的发生,发生风险的增加与宿主中细菌菌群的多态性、宿主基因型和环境暴露等多种因素有关。在其生长代谢过程中分泌多种毒力因子和炎性介质,引起 损伤和炎症反应,同时增加胃黏膜上皮细胞的增殖和凋亡能力,致使 损伤修复合成能力旺盛。在哺乳动物体内,双链断裂损伤主要通过同源重组修复(,)和非同源末端连接(,)修复来完成。同源重组修复是一种精确的修复,非同源末端连接是一种不精确的修复,前期研究表明 感染引起 损伤后抑制了 修复相关基因的表达,从而使机体选择更容易出错的
5、修复方式,从而增加了恶性肿瘤的风险。以往研究多着重于 及其重要毒力因子细胞毒素相关蛋白(,)与胃癌的流行病学研究及致病机制,但尚缺乏 及其毒力因子空泡细胞毒素(,)对 修复及细胞周期的影响。本研究拟通过 标准株和其 基因敲除株感染人胃腺癌细胞,从而检测 及其毒力因子 对 修复和细胞周期的影响。资料与方法 菌株与细胞来源 标准株及其 基因敲除株由柏林马克思普朗克生物感染所 教授馈赠,河南省幽门螺杆菌及微生态与消化道肿瘤重点实验室保存。人胃腺癌 细胞购于中国科学院上海细胞库()。主要仪器 分光光度计(美国 公司),培养箱(美国 公司),电泳及转膜设备(美国 公司),化学发光成像系统(美国 公司),
6、流式细胞仪(美国 公司)。主要试剂 兔单克隆抗体()购自美国 公司;兔单克隆抗体()购自美国 公司;鼠单克隆抗体()购自美国 公司;兔单克隆抗体()购自美国 公司;哥伦比亚琼脂、脑心浸液购自英国 公司;无菌脱纤维绵羊血(全血)购自南京便诊生物科技有限公司;热灭活马血清()购自美国 公司;培养基、胎牛血清购自以色列 公司;磷酸盐缓冲液购自美国 公司;含量检测试剂盒()购自北京 公司。培养及标准曲线制备菌株置于 、体积分数 、体积分数 和体积分数 混合气体培养箱中培养。固体培养法采用哥伦比亚琼脂做固体培养 基,其中添加体积分数 羊血、体积分数 抗生素混合溶液(由万古霉素、两性霉素、多黏菌素混合配制
7、而成),培养 后,长出针尖状半透明菌落,用接种环均匀划线接种至新的培养基传代。液体培养法 采用脑心浸液做液体培养基,添加体积分数 胎牛血清、体积分数 抗生素混合溶液,培养 后,采用分光光度计测量 波长处菌液光密度(,)值,稀释传代至新的培养瓶,于倒置显微镜下观察 的生长状态。标准曲线制备取液体培养 的菌液,用分光光度计测量 值,将菌液稀释成、倍数后,分别取 涂布于固体培养基上,后计数菌落形成单位(,),以 值为横坐标、为纵坐标绘制标准曲线,以此评估菌量。细胞系培养 细胞采用 培养基培养,添加体积分数 胎牛血清、质量分数 青霉素、质量分数 链霉素,于 、体积分数 、体积分数 和体积分数 细胞培养
8、箱中进行培养。感染细胞 用液体培养法培养,取对数生长期的菌液,用分光光度计测量 值,根据标准曲线计算对应菌量,离心 ,将沉淀用磷酸盐缓冲液洗涤 次,最后用 细胞培养基重悬,确定最终菌液浓度。感染前更换 培养基(不含胎牛血清和抗生素)饥饿细胞过夜,按照感染复数(,)将细菌悬液加入培养孔与细胞共培养 。检测 将 细胞接种于 孔板,待细胞量长至 时,以 感染细胞,以未感染细胞做阴性对照,丝裂霉素()处理细胞 作阳性对照。感染后 、收集细胞总蛋白,检测、的表达水平。利用 梯度胶进行 电泳,电压 ,转 膜,体积分数 脱脂奶粉封闭 ,一抗 孵育过夜,洗膜 次,每次 ,二抗室温孵育 ,洗膜 次,最后用 试剂
9、盒显色,使用 曝光仪曝光拍照分析。细胞周期检测将 细胞接种于 孔板,待细胞量长至 时,以 感染细胞,未感染细胞做阴性对照,感染后 离心收集细胞沉淀,用预冷磷酸盐缓冲液洗涤细胞 次,再加入 预冷乙醇 固定过夜,预冷磷酸盐缓冲液洗去固定液。细胞沉淀中加 溶液,重悬细胞,水浴 。再加入 染色液混匀,避光孵育 。用流式细胞仪检测细胞周期,软件分析各时相细胞百分比。统计学处理采用 进行统计学分析,计量资料用 表示,组间比较用 检验,检验水准 。结果 标准株和 基因敲除株感染 细胞后 损伤标记蛋白和 修复关键蛋白的表达采用 标准株和其 基因敲除株以 与 细胞共培养 、,检测 损伤标记蛋白 和 修复关键蛋白
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