珍稀植物浙江七子花炭疽病病原菌的分离和鉴定_朱晏.pdf
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1、浙江农业学报 Acta Agriculturae Zhejiangensis,2023,35(1):112 120http:/www zjnyxb cn朱晏,周梦亚,朱怡诺,等 珍稀植物浙江七子花炭疽病病原菌的分离和鉴定 J 浙江农业学报,2023,35(1):112 120DOI:10.3969/j issn 1004-1524.2023.01.12收稿日期:2022-04-06基金项目:国家级大学生创新创业训练计划(202110350016)作者简介:朱晏(1999),女,浙江长兴人,学士,研究方向为分子生物学。E-mail:1119190648 qq com*通信作者,蒋明,E-mail
2、:jiangming1973139 com珍稀植物浙江七子花炭疽病病原菌的分离和鉴定朱晏1,周梦亚1,朱怡诺1,何海叶1,鲍洪华2,张慧娟1,蒋明1,*(1 台州学院 生命科学学院,浙江 台州 318000;2 台州市生态环境保护局路桥分局,浙江 台州 318050)摘要:炭疽病是浙江七子花(Heptacodium miconioides subsp jasminoides)的重要病害之一,该病的发生严重影响植株生长,并威胁该珍稀物种的生存。为明确引起浙江七子花炭疽病病原菌的种类,以病叶为材料,采用组织分离法获得病原真菌,在确定致病性的基础上,利用形态学和多基因联合法对炭疽病病原菌进行鉴定。结
3、果表明,从叶片中共分离到 3 个菌株,经柯赫氏法则验证,证实仅 1 个菌株(QZH)能引起炭疽病;病原菌的形态特征与果生刺盘孢菌(Colletotrichum fructicola)一致。多基因联合分析结果显示,菌株 QZH 与果生刺盘孢菌在系统发育树上聚为一支,并具有较高的支持率。综合形态学特征与多基因鉴定鉴定结果,确定引起浙江七子花炭疽病的病原菌为果生刺盘孢菌。浙江七子花炭疽病病原菌的分离与鉴定为后续开展该病害的有效防治和致病机理研究提供了基础。关键词:浙江七子花;炭疽病;果生刺盘孢菌中图分类号:S436.8;S763.15文献标志码:A文章编号:1004-1524(2023)01-011
4、2-09Isolation and identification of pathogen causing anthracnose disease on a rare plant speciesHeptacodium miconioides subsp jasminoidesZHU Yan1,ZHOU Mengya1,ZHU Yinuo1,HE Haiye1,BAO Honghua2,ZHANG Huijuan1,JIANG Ming1,*(1 College of Life Sciences,Taizhou University,Taizhou 318000,Zhejiang,China;2
5、Taizhou Municipal Ecologyand Environment Bureau Luqiao Branch,Taizhou 318050,Zhejiang,China)Abstract:Anthracnose is one of the most important diseases of Heptacodium miconioides subsp jasminoides,whichseriously affects plant growth and threatens the survival of this rare species To clarify the causa
6、tive pathogen,infec-ted leaves of H miconioides subsp jasminoides were collected,and the pathogen was obtained by the tissue isolationmethod After determining the pathogenicity of the isolated strains,both morphological and multi-gene approacheswere applied to identify the causative pathogen Three s
7、trains were isolated,and only one isolate namely QZH couldcause anthracnose disease according to Kochs Rule The morphological characteristics were identical with those ofColletotrichum fructicola The multi-gene analysis results indicated that QZH and C fructicola shared the sameclade,with high suppo
8、rt rates Based on the morphological characteristics and multi-gene identification results,itwas confirmed that the pathogen causing anthracnose disease of H miconioidessubsp jasminoides was C fructicolaThese data provided a start point for both disease prevention and pathogenic mechanism studies in
9、the futureKey words:Heptacodium miconioides subsp jasminoides;anthraconse disease;Colletotrichum fructicola浙江七子花(Heptacodium miconioides subspjasminoides)为忍冬科(Caprifoliaceae)七子花属落叶小乔木,它是我国特有植物,多生于悬崖峭壁、灌丛或沟谷,分布区域十分狭窄,现存野生资源十分稀少,已列入国家重点野生保护植物名录(级)1。产于浙江、安徽的浙江七子花一直作为七子花(H miconioides)研究,新版浙江植物志 将其列为七子花
10、的亚种1。树形优美、枝繁叶茂、花形奇特,宿存萼片颜色艳丽,具有较好的观赏价值,可用作园林观赏树种2。浙江七子花叶片富含黄酮类物质,有一定的药用价值,常用于防治冠心病、高血压等疾病。植株则含有鞣质、生物碱和绿原酸等生物活性成分,有抗氧化、消炎和抑菌等功效3 4。浙江七子花内生真菌具有抑菌活性,发酵液粗提物对大肠埃希菌(Escherichia coli)和金黄色葡萄球菌(Staphylococ-cus aureus)有显著的抑制效果,可用于微生物源杀菌剂的开发5。然而,浙江七子花病害尚未引起足够重视。前期野外调查发现,浙江七子花炭疽病的发生十分严重,部分样地植株的发病率高;发病初期叶面出现褐色斑点
11、,后期多个病斑融合,严重时叶片枯死脱落。炭疽病由炭疽菌属(Colletotrichum)真菌引起,它是一种世界性病害,引起该病的病原菌种类繁多、寄主广泛、传播迅速;它们侵染叶片、枝条、花和果实等,危害多种植物;每年由该病害造成的经济损失十分巨大6。准确鉴定病原菌是病害有效防治的基础。炭疽病病原菌的鉴定方法主要有形态学、生理生化和分子生物学等,其中,分子鉴定具有可靠性高、特异性好、受环境影响小等优点,可提高病原真菌鉴定的准确性7。核糖体 DNA 内转录间隔区(internal transcribedspacer,ITS)、3-磷酸甘油醛脱氢酶(glyceralde-hyde-3-phosphat
12、e dehydrogenase,GAPDH)基因、几丁质合成酶(chitinase synthase 1,CHS-1)基因和肌动蛋白(actin,ACT)基因等的片段已广泛应用于分子鉴定7 9。近年来,浙江七子花的研究主要集中在种群结构、内生真菌分离鉴定和遗传多样性等方面,而与炭疽病相关的研究未见报道5,10 11。本研究以浙江七子花炭疽病病叶为材料,在病原菌的分离、纯化、致病性检测与形态学观察的基础上,采用多基因联合方法对病原菌进行鉴定,以明确浙江七子花炭疽病病原菌的种类,为后续开展该病害的有效防治和致病机理研究提供参考。1材料与方法1.1材料浙江七子花炭疽病病叶采自浙江临海兰辽,样地经纬度
13、分别为 121043E 和 284529N,海拔 756 m,采集带有新鲜病斑的叶片,置于取样袋带回实验室备用。1.2实验方法1.2.1病原菌的分离纯化病原菌的分离采用组织分离法,用无菌刀片切取病健交界处的组织块,在超净台上用 0.1%HgCl2溶液处理 5 min,最后用无菌水清洗 2 次。用无菌滤纸吸干水分,再用无菌刀片切成 3 mm 3 mm小块,接种至 V8 培养基上。培养温度为28,待长出菌丝后,用无菌刀片在菌落边缘切取菌丝块,转接至新的培养基进行纯化。1.2.2致病性测定依据柯赫氏法则,采用回接法对已纯化的菌株进行致病性测定。采集浙江七子花健康叶片,清洗晾干后置于铺有湿润滤纸的培养
14、皿内;用直径 5 mm 的无菌打孔器在菌落边缘切取菌饼,菌丝面朝下接种于离体叶片左侧,空白对照接种于叶片右侧,实验重复 3 次;置于 28 恒温培养箱中保湿培养,定期观察发病情况并记录结果。1.2.3形态学鉴定将纯化后的病原菌接种于 V8 培养基上,置于 28 恒温培养箱中培养。取出培养基观察、记录菌落的形态和颜色;取少量菌丝于载玻片上,滴加 2 滴蒸馏水,在倒置显微镜下观察菌丝和孢子的形态特征;将干燥后的菌丝和染病叶片粘在导电胶上,用离子溅射仪喷金处理后,置于日立 S-4800 扫描电子显微镜的样品座,观察、拍摄菌丝形态。1.3分子鉴定1.3.1基因组 DNA 的提取用无菌刀片刮取菌丝,置于
15、 1.5 mL 离心管中,加液氮研磨至粉末状。采用生工生物工程(上海)股份有限公司的“真菌基因组 DNA 快速311朱晏,等 珍稀植物浙江七子花炭疽病病原菌的分离和鉴定抽提试剂盒”提取 DNA,操作根据其提供的说明书进行。DNA 经 1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测后,置于 20 冰箱保存备用。1.3.2基因片段克隆利用 ITS、CHS-1、ACT 和 GAPDH 基因的通用引物对病原菌 DNA 进行 PCR 扩增,序列见表 1。PCR 反应体系均为 20 L:2 L 10 缓冲液、0.5L 10 mmolL1的 dNTPs(Genview,美国)、0.2L 20 molL1的上游/下游引物、30
16、 ng 模板DNA 和 0.5 L Taq DNA 聚合酶(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司),加 ddH2O 至终体积 20L。PCR 反应在 BIO-RAD S1000 PCR 仪(伯乐,美国)上进行,扩增程序为:95 5 min;95 30s,45 s(ITS、CHS-1 为 55,ACT、GAPDH 为 58),72 90 s,循环 32 次;72 10 min。PCR产物经 1.0%凝胶电泳检测后,用 BIO-RAD GelDoc XR 凝胶成像仪(伯乐,美国)拍摄记录。1.3.3基因片段的回收、连接和转化利用试剂盒法对 PCR 扩增产物进行回收、纯化,操作根据“高效 DNA 凝胶回
17、收试剂盒”(Gen-view,美国)提供的说明书进行。连接采用 Pro-mega(美国)的 pGEM-T Easy 试剂盒,在10 L 体系中依次加入 5 L 2 快速连接缓冲液、1 L 载体、3 L PCR 回收产物和 1 L T4连接酶,在 4冰箱连接过夜。利用热激法将连接产物导入大肠埃希菌 DH5 感受态细胞,经涂布培养、挑取单菌落、摇菌和菌液 PCR 检测,挑选阳性克隆用于测序。1.3.4序列分析与系统发育树的构建根据测序结果,利用 ClustalX 1.81 软件进行表 1PCR 引物序列Table 1PCR primer sequences used in this study基因
18、Gene name引物名称Primer name引物序列Primer Sequence(53)ITSITS1TCCGTAGGTGAACCTGCGGITS4TCCTCCGCTTATTGATATGCCHS-179FTGGGGCAAGGATGCTTGGAAGAAG354RTGGAAGAACCATCTGTGAGAGTTGACTIN512FATGTGCAAGGCCGGTTTCGC783RTACGAGTCCTTCTGGCCCATGAPDHGDF1CCGTCAACGACCCCTTCATTGAGDR1GGGTGGAGTCGTACTTGAGCATGT多重比对,并借助 GeneDoc 2.7.0 软件生成图像;使
19、用 MEGA 3.1 软件以邻接法(Neighbor-joiningmethod)构建系统发育树,自举检测 1 000 次。2结果与分析2.1病害发生情况与症状调查了 5 个浙江七子花样地(诸暨东白山、临海兰辽、嵊州四明山、磐安大盘山、临海括苍山),结果显示,这些样地均有炭疽病的发生,其中,兰辽样地的植株发病率达 90%,其他 4 个样地的发病率为 30%60%。发病初期,叶片表面出现褐色斑点,略凹陷,随后逐渐扩大蔓延,病斑呈圆形,边缘为深褐色,中部颜色稍浅;后期多个病斑融合,叶片出现卷曲、破裂或穿孔,严重时整张叶片枯死脱落(图 1)。2.2分离结果与致病性鉴定从浙江七子花病叶上共分离到菌株
20、3 个,依据科赫氏法则,回接实验证实仅 1 个菌株具有致病性,命名为 QZH。离体叶片接种 3 d 时菌丝逐A,患病植株;B,患病叶片;C,病斑特写。A,Infected plant;B,Infected leaf;C,Leaf lesion图 1浙江七子花炭疽病病叶Fig 1Anthracnose disease of Heptacodium miconioides subsp jasminoides411浙江农业学报第 35 卷第 1 期渐扩散,接种部位生成褐色斑点;5 d 时扩大成近圆形病斑;7 d 时病斑正面被大量白色菌丝覆盖,背面出现灰白色霉层,而对照未见发病(图 2)。发病过程中出
21、现的病斑特征与自然条件下炭疽病发病症状相同,确定菌株 QZH 为浙江七子花炭疽病的致病菌。2.3形态学鉴定在 V8 培养基中,2 d 时的菌落为白色,菌丝稀疏,5 d 时菌落中央变为浅灰色,7 d 时覆盖整个培养基,气生菌丝茂密,为白色绒毛状(图 3)。显微和亚显微结果显示:病原菌的分生孢子呈长椭圆状、表面光滑、两端钝圆、单孢,一般具 2 3个油球,菌丝细长、透明、表面粗糙,分支较多,具明显隔膜(图 3),根据形态学和培养特征初步鉴定分 离 出 的 菌 株 为 炭 疽 菌 属(Colletotrichumspp)真菌。2.4分子鉴定2.4.1基因片段的克隆PCR 扩增产物经 1.0%凝胶电泳检
22、测,ITS、CHS-1 和 ACT 均有明亮单一的特异性条带,GAP-DH 虽存在非特异性条带,但不影响割胶回收(图4)。扩增产物经回收、连接和转化后测序,得到各自的序列。ITS、CHS-1、ACT 和 GAPDH 序列的长度分别为 550、277、256、256 bp,与电泳结果一致。2.4.2序列多重比对序列多重比对结果表明,QZH 与果生刺盘孢菌(C fructicola)、宽孢炭疽菌(C chrysophilun)和胶孢炭疽菌(C gloeosporioides)的 ITS 序列完全一致,无法利用 ITS 区分这些真菌;菌株 QZH与果生刺盘孢菌的 CHS-1、ACTIN、GAPDH
23、序列相似性达 100%,与其他炭疽菌属真菌则存在一定的差异,如 QZH 与隐秘刺盘孢菌(C aenigma)、热带炭疽菌(C tropicale)、香蕉炭疽菌(C mu-sae)和亚洲炭疽菌(C asianum)在第 14 位碱基处出现转换现象,在第100 位处发生颠换(图5)。A,接种病原菌的叶片;B,接种部位正面;C,接种部位背面。A,Leaf inoculated with QZH;B,The front view of an inoculation site;C,The back view of an inoculation site图 2致病性检测结果Fig 2Result of p
24、athogenicity detectionA,菌落形态;B,倒置显微镜下孢子的形态;C、D,扫描电子显微镜下菌丝的形态。A,Colony morphology;B,Morphology of spores under a microscope;C and D:Morphology of mycelium under scanning electron microscope图 3病原菌 QZH 的形态特征Fig 3Morphological characteristics of pathogenic fungus QZH511朱晏,等 珍稀植物浙江七子花炭疽病病原菌的分离和鉴定M,DL 200
25、0 标准分子量;1、2,内转录间隔区;3、4,几丁质合成酶基因;5、6,肌动蛋白基因;7、8,3-磷酸甘油酸脱氢酶基因。M,DL 2000 DNA marker;1 and 2,ITS;3 and 4,CHS-1 gene;5 and 6,ACTIN gene;7 and 8,GAPDH gene图 4PCR 扩增产物Fig 4PCR products of different gene fragmentsQZH,果生刺盘孢菌;MN273216.1,果生刺盘孢菌;KF377525.1,葡萄炭疽病菌;MN685845.1,河南刺盘孢菌;MT602360.1,喀斯特炭疽菌;MN624087.1,胶
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