孕酮对OCTN2的抑制作用及对左旋肉碱肾脏排泄的影响_白梦如.pdf
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1、 中国现代应用药学 2023 年 1 月第 40 卷第 2 期 Chin J Mod Appl Pharm,2023 January,Vol.40 No.2 191 孕酮对 OCTN2 的抑制作用及对左旋肉碱肾脏排泄的影响 白梦如1,陈铭扬2,蒋惠娣2,马志媛1*(1.浙江大学医学院附属杭州市第一人民医院临床药学科,浙江省临床肿瘤药理与毒理学研究重点实验室,杭州 310006;2.浙江大学药学院药物代谢与分析实验室,杭州 310058)摘要:目的 考察孕酮对肉碱/有机阳离子转运体 2(carnitine/organic cation transporter 2,OCTN2)功能的影响,并探讨其
2、是否通过抑制肾脏 OCTN2 功能改变左旋肉碱肾脏排泄,从而降低妊娠期血浆左旋肉碱浓度。方法 采用已构建的稳定高表达人 OCTN2 的 MDCK-hOCTN2 细胞模型,分别以米屈肼和氘代左旋肉碱为底物,考察孕酮对 OCTN2 的抑制作用。正常雌性 ICR 小鼠皮下注射孕酮,使其达妊娠晚期血清孕酮浓度,比较其与对照组小鼠左旋肉碱尿液排泄差异,以及血浆和各组织中左旋肉碱浓度差异。结果 孕酮显著抑制 OCTN2 对米屈肼和氘代左旋肉碱的摄取,半数抑制浓度分别为8.7 molL1和 14.0 molL1。孕酮给药组小鼠血清孕酮浓度为 4621 153 nmolL1,与妊娠晚期生理浓度相当,左旋肉碱的
3、尿液排泄量以及血浆、肝脏、肾脏和心脏中左旋肉碱浓度与对照组无显著差异。结论 孕酮显著抑制 OCTN2 功能,但与妊娠晚期生理浓度相当的孕酮不影响左旋肉碱的肾脏排泄及体内稳态。关键词:肉碱/有机阳离子转运体 2(OCTN2);左旋肉碱;孕酮;肾脏排泄 中图分类号:R285.5 文献标志码:A 文章编号:1007-7693(2023)02-0191-06 DOI:10.13748/ki.issn1007-7693.2023.02.006 引用本文:白梦如,陈铭扬,蒋惠娣,等.孕酮对 OCTN2 的抑制作用及对左旋肉碱肾脏排泄的影响J.中国现代应用药学,2023,40(2):191-196.Acti
4、vity Inhibition of Progesterone on OCTN2 and its Effect on L-Carnitine Renal Excretion BAI Mengru1,CHEN Mingyang2,JIANG Huidi2,MA Zhiyuan1*(1.Department of Clinical Pharmacy,Key Laboratory of Clinical Cancer Pharmacology and Toxicology Research of Zhejiang Province,Affiliated Hangzhou First Peoples
5、Hospital,Zhejiang University School of Medicine,Hangzhou 310006,China;2.Laboratory of Drug Metabolism and Pharmaceutical Analysis,College of Pharmaceutical Sciences,Zhejiang University,Hangzhou 310058,China)ABSTRACT:OBJECTIVE To investigate the effect of progesterone on the activity of carnitine/org
6、anic cation transporter 2(OCTN2),and explore whether progesterone can reduce plasma L-carnitine concentration during pregnancy by inhibiting the renal OCTN2 activity and changing the renal excretion of L-carnitine.METHODS Used the established MDCK-hOCTN2 cell model with stable and high expression of
7、 human OCTN2,the inhibitory effect of progesterone on OCTN2 was investigated with mildronate and d3-L-carnitine as substrates.Normal female ICR mice were subcutaneously injected with progesterone to make their serum progesterone concentration reach the third trimester of pregnancy,then the urinary e
8、xcretion of L-carnitine and L-carnitine concentrations in plasma and tissues were determined and compared with the control group.RESULTS Progesterone reduced the accumulation of mildronate or d3-L-carnitine in MDCK-hOCTN2 cells in a concentration-dependent manner,and the IC50 values were 8.7 molL1 a
9、nd 14.0 molL1,respectively.The serum concentrations of progesterone were 4621 153 nmolL1 in the treated mice,which were equivalent to the physiological concentrations in late pregnancy.Compared with the control group,there were no significant differences in the urinary excretion of L-carnitine and L
10、-carnitine levels in plasma,liver,kidney and heart of mice in the progesterone treated group.CONCLUSION Progesterone significantly inhibites the activity of OCTN2 in vitro,however,progesterone at levels observed in late pregnancy do not affect L-carnitine renal excretion and homeostasis.KEYWORDS:car
11、nitine/organic cation transporter 2(OCTN2);L-carnitine;progesterone;renal excretion 基金项目:浙江省卫生健康科技计划项目(2021RC021);杭州市医药卫生科技项目(A20210336)作者简介:白梦如,女,博士,主管药师 E-mail: *通信作者:马志媛,女,博士,副主任药师 E-mail:zhiyuan_ 左旋肉碱是体内重要的生理活性物质,广泛分布于哺乳动物的血液和各组织中,其生理作用是协助细胞质中的长链脂肪酸进入线粒体,促进脂肪酸 氧化1。左旋肉碱为亲水性的两性离子化合物,其被动扩散能力较弱,需要由转
12、运体介导其跨细胞膜转运。肉碱/有机阳离子转运体 2(carnitine/organic cation transporter 2,OCTN2),由 SLC22A5 基因编码,对左旋肉碱具有特异性高亲和力,参与左旋肉碱的细胞摄取,主要于成人肾脏、骨骼肌、胎 192 Chin J Mod Appl Pharm,2023 January,Vol.40 No.2 中国现代应用药学 2023 年 1 月第 40 卷第 2 期 盘、心脏和前列腺表达,脑、肺、肝脏也有一定表达2-3。左旋肉碱在体内不被代谢,经肾小球滤过以原型排至尿液中,而位于肾小管上皮细胞顶侧的 OCTN2 则介导了绝大部分左旋肉碱的重吸收
13、,以维持左旋肉碱体内稳态1-2。OCTN2 功能障碍可导致体内左旋肉碱稳态失衡,而左旋肉碱缺乏会引起脂肪酸 氧化异常,进而导致心肌病、骨骼肌无力、低血糖和脂肪肝等一系列代谢性疾病4-7。研究表明,妊娠期女性的血浆左旋肉碱浓度随妊娠进行持续降低8-10,而血脂则逐渐升高11-12。笔者所在课题组前期研究显示妊娠小鼠血浆左旋肉碱浓度亦显著低于未妊娠小鼠13。孕酮亦称黄体酮,是一种天然孕激素,人和小鼠妊娠期血清孕酮浓度显著升高,妊娠足月时约为非妊娠期的数十倍14-15,且有文献报道孕酮可竞争性抑制 BeWo细胞摄取左旋肉碱16。妊娠期高浓度的孕酮能否通过抑制肾脏 OCTN2 功能改变左旋肉碱肾脏排泄
14、,从而降低血浆左旋肉碱水平尚不清楚。因此,本研究首先利用稳定高表达人 OCTN2 的细胞模型考察孕酮对 OCTN2 功能的影响,进一步应用实验动物探究孕酮对左旋肉碱肾脏排泄的影响。1 材料与方法 1.1 试剂与仪器 米屈肼(大连美仑公司,批号:J0920AS;纯度 98%);氘 代 左 旋 肉 碱(Cambridge Isotope Laboratories 公司,货号:DLM-10961-PK;纯度98%);左旋肉碱(批号:J1423007;纯度:98%)、孕酮(批号:L1909153;纯度:98%)均购自上海阿拉丁公司;胰酶(批号:1910485)、DMEM 高糖培养基(批号:180652
15、5)、胎牛血清(批号:1908121)、青-链霉素溶液(批号:2018052503)均购自美国Gibco 公司;二甲基亚砜(DMSO,批号:SHBJ7919;纯 度 99.5%)、碘 化 N-甲 基-4-苯 基 吡 啶盐(MPP+,批号:911295-24-4)、十二烷基硫酸钠(批号:BCBZ6968;纯度99%)均购自美国 Sigma公司;茶油(浙江田雨山药用油有限公司,批号:20180401);BCA 蛋白浓度测定试剂盒(上海碧云天生物技术研究所,批号:P0011);乙腈(色谱纯,美国 Tedia 公司,批号:18095192);其他试剂均为分析纯或更高级别。3111 型细胞培养箱(美国
16、Thermo 公司);Centrifuge 5425R型 高 速 冷 冻 离 心 机(德 国Eppendorf 公司);tissuelyser-48 型全自动样品快速研磨仪(上海净信科技公司);GBL-88B 型涡旋震荡仪(海门市其林贝尔仪器公司);1290-6460 型高效液相色谱-质谱联用仪(LC-MS/MS,美国 Agilent公司);E170 全自动电化学发光免疫分析仪(瑞士Roche 公司)。1.2 细胞培养 稳定高表达人 OCTN2 的细胞模型 MDCK-hOCTN2 和对照细胞模型 MDCK-pcDNA3.1(+)(以下简称“mock”)由本实验室构建和保存17-18。MDCK-
17、hOCTN2 和 mock 细胞培养在含 10%胎牛血清、1%青-链霉素的 DMEM 高糖培养基中,放置于37 和5%CO2饱和湿度的细胞培养箱中,待细胞生长至 80%90%汇合度,用 0.25%胰酶消化传代。1.3 MDCK-hOCTN2 细胞功能鉴定 MDCK-hOCTN2 及 mock 细胞以每孔 2105的密度接种于 24 孔板,生长至 90%汇合度时进行米屈肼和氘代左旋肉碱(均为 OCTN2 底物,浓度为 2 molL1)的积聚试验,设立加或不加左旋肉碱(此处作为抑制剂,浓度为 100 molL1)组,每组平行 3 份。具体方法:用 37 的孵育液(含 NaCl 125 mmolL1
18、、KCl 4.8 mmolL1、葡 萄 糖 5.6 mmolL1、KH2PO4 1.2 mmolL1、CaCl2 1.2 mmolL1、MgSO4 1.2 mmolL1、HEPEs 25 mmolL1,KOH 调至 pH 7.4)17洗涤细胞 2 次,加入孵育液 200 L 预孵育 20 min,吸弃孵育液,加入含药物的孵育液 200 L,37 孵育 3 min,吸弃孵育液。用冰冷的孵育液快速洗涤 2 次,每孔加入 0.1%十二烷基硫酸钠溶液 100 L,反复吹打裂解细胞,收集细胞裂解液,以 LC-MS/MS 检测米屈肼和氘代左旋肉碱的浓度。1.4 孕酮对 OCTN2 功能的影响 将 MDCK
19、-hOCTN2 细胞以 2105每孔接种于24 孔板,生长至 90%汇合度时进行积聚实验,分为底物组和混合组。底物组为 2 molL1米屈肼或氘代左旋肉碱,混合组为含梯度浓度的孕酮且含2 molL1米屈肼或氘代左旋肉碱,药物均配制在孵育液中,孕酮浓度梯度为 0.01,0.1,1,5,10,20,50 molL1,每组平行 3 份,细胞积聚试验过程同上。1.5 动物 910 周龄健康 ICR 小鼠(n=24),体质量(302)g,由北京维通利华实验动物技术有限公司提供动物生产许可证号:SCXK(京)2016-0011;中国现代应用药学 2023 年 1 月第 40 卷第 2 期 Chin J M
20、od Appl Pharm,2023 January,Vol.40 No.2 193 动物合格证号:1805240007,SPF 级,饲养于温度(222)和湿度(555)%,12 h 光照阴暗交替周期,自由饮水进食,于实验开始前适应性喂养 1周。所有实验过程均获得了浙江大学医学中心动物保护和使用委员会的批准(批件号:2015-0026),符合中国动物福利标准。1.6 动物给药与样品收集 将 24 只 ICR 小鼠,采用配对比较法随机分成2 组,每组 12 只。实验组每天皮下注射孕酮100 mgkg1,对照组皮下注射空白溶剂茶油,分别放置于代谢笼中(采用完全随机分组法将每组小鼠随机分为 6 笼,
21、每笼 2 只),收集 24 h 尿液,给药前收集 1 d,给药后连续收集 4 d,记录尿液体积,0.22 m 滤膜过滤,以 LC-MS/MS 测定尿液左旋肉碱浓度,左旋肉碱每日尿液排泄量=左旋肉碱浓度每日尿液体积。小鼠末次给药后 24 h 采血(1份加肝素抗凝,1 份不加),4、850 g 离心 10 min分离得到血浆和血清,颈椎脱臼处死小鼠后收集肝脏、肾脏、心脏和骨骼肌组织,各组织以溶剂(乙腈水=73)制成 20 mgmL1组织匀浆液,以LC-MS/MS 测定血浆和组织左旋肉碱的浓度。1.7 样品处理与 LC-MS/MS 测定 细胞样品:取细胞裂解液 50 L,加入含内标MPP+(15 n
22、gmL1)的乙腈溶液 400 L,涡旋5 min 沉淀蛋白,4、16 000 g 离心 15 min,取上清液,以 LC-MS/MS 检测米屈肼和氘代左旋肉碱的浓度,并以 BCA 法测定细胞裂解液的蛋白浓度加以校正。动物样品:取血浆/尿液各 20 L,蒸馏水稀释50 倍,精密量取 50 L 至离心管内,加入含内标MPP+(15 ngmL1)的乙腈溶液 400 L;取组织匀浆液 50 L,加入含内标 MPP+(15 ngmL1)的乙腈溶液 400 L;涡旋 5 min 沉淀蛋白,4、16 000 g离心 15 min,取上清液,以 LC-MS/MS 检测左旋肉碱的浓度。米 屈 肼、左 旋 肉 碱
23、 和 氘 代 左 旋 肉 碱 的LC-MS/MS 检测方法参考本课题组前期研究17,19。具体为应用 Agilent 1290/6460 三重四级杆质谱;色谱柱为 Xbridge BEH HILIC 柱(50 mm2.1 mm,2.5 m);流动相 A 为含 0.1%甲酸的 20 mmolL1乙酸铵-水溶液,B 为含 0.1%甲酸的乙腈;梯度洗脱:01 min(20%A),12.6 min(20%30%A),2.62.7 min(30%20%A);进样量:2 L;流速:0.2 mLmin1;时间 4 min;柱温 35。电离方式ESI,检测模式 MRM,正离子检测。质谱条件:毛细管电压 3.5
24、 kV;气化温度 350;气化气流量 5 Lmin1;喷雾压力 60 psi;鞘气温度 350;鞘气流量 11 Lmin1;其他参数见表 1。表 1 质谱参数 Tab.1 Mass spectrum parameters 待测物 质荷比(母离子/子离子)碎裂电压/V 碰撞能量/eV米屈肼 147/58.1 100 32 左旋肉碱 162.2/60.2 115 15 氘代左旋肉碱165.2/63.2 115 15 MPP+(内标)170/128 100 30 1.8 孕酮浓度测定 小鼠血清孕酮浓度由杭州艾迪康医学检验中心使用全自动化学发光免疫分析仪进行测定。1.9 数据分析 实验数据用 Grap
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