长链非编码RNA60304...腹膜透析超滤衰竭发生的机制_李欣绪.pdf
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1、安 徽 医 药 Anhui Medical and Pharmaceutical Journal 2023 Feb,27(2)长链非编码RNA6030408B16RIK结合微小RNA-326-3p参与腹膜透析超滤衰竭发生的机制李欣绪1,周忠启2,王志奎2,张磊2,孙丽娜2,蔄瑜林2作者单位:1山东第一医科大学研究生院,山东 泰安271000;2临沂市人民医院肾内科,山东 临沂276000通信作者:周忠启,男,主任医师,硕士生导师,研究方向为终末期肾病的诊治Email:基金项目:山东省自然科学基金面上项目(ZR2019MH126)摘要:目的 研究长链非编码RNA6030408B16RIK(Lnc
2、RNA6030408B16RIK)结合微小RNA(miRNA-326-3p)致大鼠尿毒症模型腹膜纤维化的机制,为预防超滤衰竭提供新的依据。方法 将36只造模成功的尿毒症大鼠分为六组,每组6只大鼠,分别为:尿毒症组(不行腹膜透析治疗),空白组(腹膜透析4周),NC组(腹膜透析4周+转染空质粒),inhibitor NC组(腹膜透析4周+转染空质粒抑制剂),miR-326-3p mimic组(腹膜透析4周+miR-326-3p模拟物),miR-326-3p inhibitor组(腹膜透析4周+miR-326-3p抑制剂)。构建LncRNA6030408B16RIK原始序列载体及LncRNA6030
3、408B16RIK突变体载体,将miR-326-3p模拟物及模拟物阴性对照(mimic NC)分别与荧光素酶报告载体共同转入HEK-293T细胞中;以双荧光素酶报告实验、RNA pull down实验验证LncRNA6030408B16RIK与miR-326-3p的靶向关系,用实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应(qRT-PCR)和蛋白质印迹法(Western blotting)分析包括-平滑肌肌动蛋白(-SMA)、成纤维细胞特异性蛋白-1(FSP1)、波形蛋白(Vimentin)、E-钙黏蛋白(E-cadherin)等在内的多种腹膜纤维化相关因子的表达情况。结果 双荧光素酶实验结果:pWt-Ln
4、cRNA6030408B16RIK(野生 型 LncRNA6030408B16RIK)的 荧 光 素 酶 活 性(0.490.05)比(1.010.11)明 显 降 低(P0.05)。与尿毒症组相比,miR-326-3p mimic组中-SMA、FSP1、波形蛋白表达量 (0.510.06)、(0.220.03)、(0.610.06)比(0.810.09)、(0.620.08)、(0.960.10)明显下降,E-钙黏蛋白 (1.990.21)比(1.140.14)明显上升(P0.05),而与空白组相比,miR-326-3p inhibitor组中-SMA、FSP1、波形蛋白表达 (1.570.
5、16)、(1.160.18)、(1.720.17)比(0.920.09)、(0.640.07)、(0.920.10)明显上升,E-钙黏蛋白表达 (0.620.06)比(1.140.15)明显下降(P0.05)。结论 LncRNA6030408B16RIK可直接结合miR-326-3p,而过表达miR-326-3p可抑制尿毒症大鼠腹膜透析超滤衰竭的发生。关键词:腹膜纤维化;尿毒症;超滤;腹膜透析;microRNA-326-3p;双荧光素酶报告实验Mechanism of long noncoding RNA 6030408B16RIK binding to miRNA-326-3p involv
6、ed in the development of ultrafiltration failure by peritoneal dialysisLI Xinxu1,ZHOU Zhongqi2,WANG Zhikui2,ZHANG Lei2,SUN Lina2,MAN Yulin2Author Affiliations:1School of Postgraduates,Shandong First Medical University,Taian,Shangdong 271000,China;2Department of Nephrology,Linyi Peoples Hospital,Liny
7、i,Shandong 276000,ChinaAbstract:Objective To investigate the mechanism of long noncoding RNA 6030408B16RIK(lncRNA6030408B16RIK)binding to microRNA(miRNA-326-3p)causing peritoneal fibrosis in a rat uremic model to provide a new basis for the prevention of ultrafiltration failure.Methods A total of 36
8、 successfully modeled uremic rats were divided into 6 groups with 6 rats in each group:the uremic group(without peritoneal dialysis treatment),blank group(peritoneal dialysis for 4 weeks),NC group(peritoneal dialysis for 4 weeks+transfected empty plasmid),inhibitor NC group(peritoneal dialysis for 4
9、 weeks+transfected empty plasmid inhibitor),miR-326-3p mimic group(peritoneal dialysis for 4 weeks+miR-326-3p mimic),and miR-326-3p inhibitor group(peritoneal dialysis for 4 weeks+miR-326-3p inhibitor).The lncRNA6030408B16RIK original sequence vector and lncRNA6030408B16RIK mutant vector were constr
10、ucted,and the miR-326-3p mimic and mimic negative control(mimic NC)were transferred into HEK-293T cells together with the luciferase reporter vector respectively.Dual-luciferase reporter assay and RNA pull down assay were used to verify the targeting relationship between lncRNA6030408B16RIK and miR-
11、326-3p,and the expression of various peritoneal fibrosis-related factors including-smooth muscle actin(-SMA),fibroblast-specific protein-1(FSP1),vimentin(Vimentin),and E-calmodulin(E-cadherin)-SMA,FSP1,vimentin and E-cadherin were analyzed by RTqPCR and Western blotting.Results The dual-luciferase a
12、ssay showed that the 临床医学引用本文:李欣绪,周忠启,王志奎,等.长链非编码RNA6030408B16RIK结合微小RNA-326-3p参与腹膜透析超滤衰竭发生的机制 J.安徽医药,2023,27(2):265-270.DOI:10.3969/j.issn.1009-6469.2023.02.012.265安 徽 医 药 Anhui Medical and Pharmaceutical Journal 2023 Feb,27(2)relative luciferase activity of pWt-lncRNA6030408B16RIK(wild-type lncRNA
13、6030408B16RIK)was significantly lower(0.490.05)vs.(1.010.11)(P0.05).Compared with the uremic group,the expression of-SMA,FSP1 and vimentin(0.510.06),(0.220.03),(0.610.06)vs.(0.810.09),(0.620.08),(0.960.10)was significantly decreased in the miR-326-3p mimic group,and E-cadherin(1.990.21)vs.(1.140.14)
14、was significantly increased(P0.05).Compared with the blank group,in the miR-326-3p inhibitor group,the expression of-SMA,FSP1 and vimentin(1.570.16),(1.160.18),(1.720.17)vs.(0.920.09),(0.640.07),(0.920.10)significantly increased in the miR-326-3p inhibitor group,and E-cadherin(0.620.06)vs.(1.140.15)
15、was significantly decreased(P0.05).Conclusion LncRNA6030408B16RIK directly binds miR-326-3p,and overexpression of miR-326-3p inhibits the development of peritoneal dialysis ultrafiltration failure in uremic rats.Key words:Peritoneal fibrosis;Uremia;Ultrafiltration;Peritoneal dialysis;MicroRNA-326-3p
16、;Dual-luciferase reporter assay终末期肾脏病(end stage renal disease,ESRD)发病率高、病情危重且预后较差,且家庭、社会经济负担高,因而一直是全球关注的重要卫生问题1。腹膜透析(peritoneal dialysis,PD)以清除肾损伤病人尿毒症毒素的方式改善腹膜透析病人生活质量2-3。目前的统计表明,中国过去十年间腹膜透析的使用率急剧上升(超过10倍)1。但长期接触生物不相容性的腹透液会导致明显的腹膜纤维化(peritoneal fibrosis,PF),这些变化包括腹膜间皮细胞间充质转分化、细胞外基质沉积致间皮细胞下层增厚以及血管生成
17、。并且高糖溶液能够引起腹膜组织发生上皮细胞向间充质细胞转化(epithelial-musenchymal transdifferentiation,EMT)4。反复发生腹膜炎、腹膜纤维化易致腹膜损伤后超滤衰竭(ultrafiltration failure,UFF),成为目前退出腹膜透析最主要、最常见的原因之一。据研究,包括LncRNA、miRNA等内的非编码RNA参与了腹膜透析的超滤衰竭5-8。刘莹等9报道,LncRNA NEAT-1通过miR-34a激活PI3K-AKT信号通路影响上皮间质转分化。本课题组通过生物学预测网站预测了LncRNA6030408B16RIK与miR-326-3p之
18、间的结合位点,并且前期实验已经证实LncRNA6030408B16RIK的表达下调可能改善了腹膜纤维化进程延缓了超滤衰竭的发生。本实验目的在于使用双荧光素酶报告实验以及 RNA pull down实验研究LncRNA6030408B16RIK与miR-326-3p的靶向关系,在超滤衰竭的生发、始动环节进行预防,为保护腹膜功能提供新的靶点和思路。本研究于 2019年 7月至 2020年 6月通过双荧光素酶 报 告 实 验 以 及 RNA pull down 实 验 验 证 LncRNA6030408B16RIK 结合 miR-326-3p 参与腹膜透析超滤衰竭发生的机制。1材料与方法1.1实验材
19、料36只使用5/6肾脏切除术造模成功的尿毒症模型Sprague Dawley大鼠,体质量为185200 g(广东省医学实验动物中心,动物许可证号SCXK,粤2013-0002)。3戊巴比妥钠麻醉注射液、3H2O2(美国 Sigma-Aldrich Chemical Company),4.25%腹透液、一抗兔抗胶原抗体、二抗山羊抗兔免疫球蛋白G(英国Abcam Inc,Cambridge),兔源抗Collagen、CD31 抗体,miR-326-3p 模拟物、miR-326-3p抑制剂和NCs(广州RiboBio Co,Ltd.)。本研究符合一般动物实验伦理学原则。1.2实验方法1.2.1尿毒症
20、模型构建及分组选取40只正常喂养1周的大鼠参照文献 10-11 进行尿毒症模型构建,首先抽取大鼠尾部血测正常肌酐值,后用3戊巴比妥钠麻醉,碘伏液消毒,选择左侧距离肋下肌约 1.5 cm,平行于脊柱旁开 1 cm 的位置行纵行切口,依次切开大鼠的皮肤、筋膜层及肌层,识别左侧肾脏。后充分分离肾脏周围组织,结扎后将左侧肾脏的上1/3和下1/3一起取出,后用明胶海绵压迫止血,检查无出血后,逐层缝合切口。1周后以同样方法行右侧肾脏切除,确定右侧肾脏准确位置后,用丝线于肾门处结扎肾脏,后从结扎处切下右肾,检查确认无出血后,依次缝合肌层及皮肤。2次手术后都给予青霉素注射3日预防感染发生。造模手术4周后,抽取
21、大鼠尾血测肌酐值,测量为正常值的23倍者则造模成功。造模手术过程中2只大鼠死亡,后有2只死于腹膜炎,将构建成功的36只大鼠尿毒症模型分为六组,每组6只大鼠(不成功大鼠已经剔除),分别为:尿毒症组(不进行腹膜透析治疗),空白组(腹膜透析4周),NC组(腹膜透析4周+转染空质粒),inhibitor NC组(腹膜透析4周+转染空质粒抑制剂),miR-326-3p mimic 组(腹膜透析 4 周+miR-326-3p模拟物),miR-326-3p inhibitor组(腹膜透析4周+miR-326-3p抑制剂)。1.2.2腹膜平衡试验(PET)大鼠腹膜透析诱导结束2 d后,将2 mL 4.25%的
22、腹膜透析液注入大鼠腹腔中,并留取0.1 mL测量0 h大鼠的超滤量及葡萄糖转运量。透析2 h后,沿腹白线行一切口打开腹266安 徽 医 药 Anhui Medical and Pharmaceutical Journal 2023 Feb,27(2)腔,抽取其中的腹透液,而后准确量取腹透液量,并用纱布吸净腹腔内残余液体,称重,后计算超滤量及葡萄糖转运量。计算方法:超滤量(ultrafiltration,UF)=(总出量入量)mL;葡萄糖转运量(mass transfer of glucose,MTG)=(葡萄糖浓度初始透析液量初始)(葡萄糖浓度透析末透析液量透析末)mmol/kg。1.2.3H
23、E染色处死大鼠后收集腹膜组织,切片制作完成后室温下干燥1.5 h。过滤去除氧化的杂质,经苏木精染色液染色5 min后,浸泡入蒸馏水中洗去多余的染色液,后以 1%的盐酸乙醇分化 5 s。将样品置于流水中至少洗涤30 min,直到细胞变蓝。用 1%曙红染液染色 1 min 后,依次在梯度乙醇(70%、80%、95%、100%)中脱水,分别用 95%和100%乙醇洗涤 2 次,每次 5 min。然后经二甲苯()、二甲苯()清洗,各5 min,擦去多余的二甲苯,并在二甲苯干燥前以中性胶密封,盖上盖玻片干燥过夜。使用直立显微镜观察样品,并用CTS成像系统记录照片。1.2.4Masson染色切片脱蜡后,依
24、次经自来水、蒸馏水洗涤,细胞核用Regaud苏木精染液染色。水洗后,将切片在Ponceau酸液中浸泡8 min,在2%冰醋酸溶液中浸泡1 min。甩干玻片上的水分后以1%磷钼酸水溶液分化4 min,擦掉多余液体后,用苯胺盐染色5 min。将切片置于0.2%冰醋酸溶液和95%无水乙醇中浸泡2 min,以去除多余染液。最后,经二甲苯清洗后,以中性树胶封固。1.2.5免疫组化将切片于60 的恒温箱里加热1 h,浸入二甲苯溶液中脱蜡,而后依次置于梯度乙醇中脱水,然后在37 的3%H2O2中孵育30 min,经磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后,浸入 95 的 1%柠檬酸缓冲液中煮沸 20 min。冷却至室温
25、后,切片用PBS冲洗,在37 下用山羊血清封闭10 min,后加入一抗兔抗胶原抗体,于4 下放置12 h。然后PBS冲洗后,加入二抗山羊抗兔免疫球蛋白G(IgG),于37 下孵育 10 min。在标本中滴加辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素溶液,并孵育10 min。然后将DAB 显色剂加入样本中,置于室温暗室中显色 8 min。切片用苏木精复染,脱水封片后,在光学显微镜下观察。1.2.6双荧光素酶报告实验使用生物学预测网站(https:/cm.jefferson.edu/rna22/)进行 miR-326-3p与 LncRNA6030408B16RIK 的结合位点分析,并获取含有作用位点的片段序列
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