油菜(Brassica_n...克隆、序列分析及亚细胞定位_董云.pdf
《油菜(Brassica_n...克隆、序列分析及亚细胞定位_董云.pdf》由会员分享,可在线阅读,更多相关《油菜(Brassica_n...克隆、序列分析及亚细胞定位_董云.pdf(10页珍藏版)》请在咨信网上搜索。
1、西 北 农 业 学 报 ,():油菜(),木糖基转移酶基因 克隆、序列分析及亚细胞定位收稿日期:修回日期:基金项目:国家自然科学基金(,);甘肃省科技计划重大项目();甘肃省农科院院列现代生物育种专项();甘肃省农科院院列重点研发计划()。第一作者:董云,男,博士,副研究员,主要从事油菜育种研究。:通信作者:吴旺泽,男,博士,副教授,主要从事油菜冷冻适应性机制研究。:董云,吴旺泽,靳丰蔚,方彦,刘婷婷,王毅,徐一涌,杨晓明(甘肃省农业科学院 作物研究所,兰州 ;西北师范大学 生命科学学院,兰州 ;甘肃农业大学,省部共建干旱生境作物学国家重点实验室,兰州 )摘要糖基转移酶(,)广泛参与植物次生物
2、质的代谢及生物和非生物胁迫,木糖基转移酶属于糖基转移酶 家族成员。为了探究油菜,木糖基转移酶对油菜次生物质的代谢和逆境调控,利用 和 方 法 从 甘 蓝 型 油 菜 中 扩 增 获 得 油 菜,木 糖 基 转 移 酶 基 因 全长 ,该 具有 的完整开放阅读框,编码 个氨基酸,分子质量约 ,由 个原子组成,分子式为 ,具有多个磷酸化位点和糖基化修饰位点,属非分泌性单次跨膜蛋白。结构域分析表明,具有 家族保守的 保守结构域和 糖基转移酶 特征结构域,属于糖基转移酶 家族成员。亚细胞定位初步显示 定位于细胞质中,蛋白互作预测表明 与各类糖合成和转运蛋白高度互作。结构域预测和互作分析初步表明,属于油
3、菜糖基转移酶 家族成员,可能通过与糖合成和转运相关蛋白互作参与油菜木糖的合成代谢进而参与生长发育及逆境响应。关键词,木糖基转移酶;甘蓝型油菜();生物信息学;亚细胞定位糖基转移酶(,)广泛存在于原核生物、真核生物、古细菌及病毒中,具有催化蛋白质、糖类、脂质、激素、黄酮等物质进行糖基化的功能。通过糖基化反应能使特定的糖基集团从一些供体转移到靶受体形成糖苷等次生代谢物。另外,糖基转移酶还能催化各类糖转变为各种受体分子,改变受体分子的稳定性,水溶性以及受体分子的生物活性和转运能力,从而介导植物生长发育、次生物质代谢、生物及非生物胁迫响应。在植物体内,免疫相关复合物如水杨酸、酚类化合物、硫配糖体等三萜
4、类化合物合成的最后修饰步骤就是糖基化过程。通过全基因组数据分析,发现真核生物基因组里大概有的基因编码糖基转移酶。目前,根据 序列的相似度以及催化底物的特异性和催化产物的立体化学结构,在碳水化合物 活性 酶 数 据 库 ()中,已经发现 个糖基转移酶家族(),其中 家族包含最多的家族成员。戊糖和 己糖是糖基转移酶 家族大多成员的反应底物,其中 糖基转移酶()是催化 糖的糖基转移酶。在模式植物拟南芥中已经发现 多个糖基转移酶基因,在芸薹属物种甘蓝型油菜()、甘 蓝()和 白 菜()中已经分别鉴定 、个 糖基转移酶基因,这些糖基转移酶主要参与次生代谢物质的合成、生物和非生物胁迫。例如 和 在拟南芥中
5、通过 关 联茉 莉 酸 和 水杨酸来响应假单胞菌侵染,拟南芥 和 能通过改变吲哚衍生物参与盐与活性氧胁迫抗性。被发现在甘蓝型油菜中通过抑制芥子酸来响应非生物胁迫。蔡明亮等 从贵州地方稻种平塘黑糯()低温转录组文库中,筛选到一个响应低温的糖基转移酶基因 ,初步的表达分析认为该基因能被低温诱导,与日本晴()栽培种相比,序列具有丰富的 多态性。中药材植物中,像黄酮类化合物、咖啡酸及其衍生物等次生代谢物,对药性及药材道地性极其重要,在这些次生代谢物的合成过程中,糖基转移酶具有重要的作用。例如在新疆紫草咖啡酸及其衍生物合成过程中,葡萄糖基转移酶(,)调节的苯丙烷途径发挥了重要作用。黄酮类化合物是三七重要
6、的药性成分,重组蛋白试验发现三七糖基转移酶 在体外能催化黄酮糖苷化产物的合成。这些证据充分证明,糖基转移酶在植物生长发育,尤其是生物、非生物胁迫中具有重要功能。因此深入了解油菜中糖基转移酶的生物学功能,通过遗传学和生物技术等手段提高油菜品质和逆境抗性具有重要的理论意义和应用价值。油菜是中国重要的油料作物之一,同时也是发展生物能源的优良经济作物。油菜生长发育过程中经常受到高温、干旱、冻害、病害、虫害等逆境的影响,造成油菜产量和品质严重下降 。鉴定,挖掘抗逆相关的基因和(,),是分子标记辅助选育高抗油菜新品种的先决条件。但与传统模式植物拟南芥和水稻等相比,在油菜中与品质和抗逆相关的基因功能研究相对
7、落后。本研究利用 和 技术从甘蓝型油菜()中扩增了,木糖基转移酶基因 ()的 端和 端序列,拼接后获得该基 因 的 全 长 序 列(登 记 号 ,命名为 ),对其全序列进行生物信息学分析,并通过构建融合表达载体 ,利用烟草瞬时表达系统进行 亚细胞定位,为将来进一步研究,木糖基转移酶基因 在油菜次生物质代谢及逆境响应中的生物学功能奠定理论基础。材料与方法 材 料 植物材料参试油菜为甘蓝型()栽培品种 ,烟草为本氏烟草()。菌株和载体农杆菌 、大肠杆菌()感受态细胞 、植物表达载体 、克 隆 载 体 购自陕西博瑞德生物科技公司。酶、试剂盒和主要的化学试剂 聚合酶 、胶回收试剂盒()、限制性内切酶
8、、,购自陕西博瑞德生物科技公司;试剂盒和 均购自 公 司;试剂盒购自 公司。方 法 油菜总 的提取油菜总 采用 法提取,提取方法参考其说明书。油菜,木糖基转移酶基因 克隆根据 中已登记的甘蓝型油菜,木糖基转移酶基因保守区序列(:),设 计 和 引物,引物由上海生物工程公司合成,相关引物序列见表。以总 为模板,使用 试 剂 盒 和 试剂盒分别进行 端序列和 端序列扩增,反转录及 扩增均参照试剂盒说明进行。将 和 第轮 产物分别进行电泳,对目的片段的回收、连接、转化,挑取阳性克隆送上海生物工程公司测序。利用 软件拼接 和 扩增获得的 端、端片段序列和原来的保守区序列。油菜,木糖基转移酶基因 生物
9、信 息 学 分 析利 用 (:)预测 氨基酸序 列 分 子 量 和 等 电 点。利 用 中 的 ,分别进行 蛋白保守性、糖基化位点、磷酸化位点、蛋白信号肽、跨膜结构、蛋白质三级结构和互作蛋白的预测;利用 软件同源比对芸薹属物种 氨基酸序列。期董云等:油菜(),木糖基转移酶基因 克隆、序列分析及亚细胞定位表 和 引物序列 引物名称 序列()油菜,木糖基转移酶基因 融合表达载体构建通过 软件查找拼接后基因全长的开放阅读框,在起始密码子和终止密码子附近设计开放阅读框的上下游引物 、。因克隆的基因序列较长,为保证克隆 的 片 段 无 突 变,在 序 列 中 间 设 计 引 物 、,分别与上下游引物配对
10、进行 扩 增,引物 序 列 见 表。反应体系:模表克隆的相关引物序列 引物名称 序列()片段大小 板 ,(),(),(),(),。反应条件:预变性 ;循环为 变性,退火,延伸 ,共 个循环;延伸 。参照胶回收试剂盒()、克隆载体 的使用说明书回收目的片段,并分别与 载体连接。按照董云等 的方法进行连接产物的转化、质粒抽提,使用 和 ,和 进行双 酶 切 鉴 定,双 酶 切 体 系:,质粒 ,或 (),(),。分 别 用 和 ,和 ,和 将鉴定正确的重 组 质 粒 和 植 物 表 达 载 体 质粒进行双酶切,经琼脂糖凝胶电泳检测后进行胶回收及纯化(方法同前)。对胶回收的目的基因两个片段及载体 大
11、片段进行体外连接(图)、转化大肠杆菌 感受态细胞,在含 的 固体培养基中培养;再将转化出来的单菌落通过摇菌后用 进行菌液 鉴定,鉴定正确的菌液送测序并保存菌液。油菜,木糖基转移酶 亚细胞定位参照郝丽芬等 的方法,构建的融合表达载体 导 入 农 杆 菌 ,并瞬时转染本氏烟草叶片,侵染后切取侵染区域,在 激光共聚焦显微镜()观察亚细胞定位。图融合表达载体 构建 结果与分析 油菜,木糖基转移酶基因 克隆根据 中已登记的甘蓝型油菜,木糖基转移酶基因 保守区序列,设计 引物和 引物,使用 和 试剂盒分别扩增获得 和 的,木糖基转移酶基因 端片段(图)和 端片段(图)。对,木糖基转移酶基因 端和 端的目的
12、条带分别进行切胶回收、纯化,纯化后的 产物分别西北农业学报 卷与 连接,转化大肠杆菌后挑取阳性克隆测序,测序结果见图和。测序正确后,利用 软件将克隆获得的 基因 端序列和 端序列与保守区序列拼接,拼接后测序表明,油菜 含有 的完整开放阅读框,编码 个氨基酸,该基因命名为 (登记号 )。油菜,木糖基转移酶基因 生物信息学分析利用测序氨基酸序列,同源比对芸薹属基因 编码的氨基酸序列,发现与甘蓝型油菜()、白菜()、芥 菜型油菜()、甘蓝()和黑芥()具有高度的相 似 性,相 似 性 分 别 为 、和 ,与同科的拟南芥 相似性为 。保守域结构比对发现,油菜 具有 家族保守的 保守结构域(表示除脯氨酸
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 油菜 Brassica_n 克隆 序列 分析 细胞 定位 董云
1、咨信平台为文档C2C交易模式,即用户上传的文档直接被用户下载,收益归上传人(含作者)所有;本站仅是提供信息存储空间和展示预览,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对上载内容不做任何修改或编辑。所展示的作品文档包括内容和图片全部来源于网络用户和作者上传投稿,我们不确定上传用户享有完全著作权,根据《信息网络传播权保护条例》,如果侵犯了您的版权、权益或隐私,请联系我们,核实后会尽快下架及时删除,并可随时和客服了解处理情况,尊重保护知识产权我们共同努力。
2、文档的总页数、文档格式和文档大小以系统显示为准(内容中显示的页数不一定正确),网站客服只以系统显示的页数、文件格式、文档大小作为仲裁依据,平台无法对文档的真实性、完整性、权威性、准确性、专业性及其观点立场做任何保证或承诺,下载前须认真查看,确认无误后再购买,务必慎重购买;若有违法违纪将进行移交司法处理,若涉侵权平台将进行基本处罚并下架。
3、本站所有内容均由用户上传,付费前请自行鉴别,如您付费,意味着您已接受本站规则且自行承担风险,本站不进行额外附加服务,虚拟产品一经售出概不退款(未进行购买下载可退充值款),文档一经付费(服务费)、不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
4、如你看到网页展示的文档有www.zixin.com.cn水印,是因预览和防盗链等技术需要对页面进行转换压缩成图而已,我们并不对上传的文档进行任何编辑或修改,文档下载后都不会有水印标识(原文档上传前个别存留的除外),下载后原文更清晰;试题试卷类文档,如果标题没有明确说明有答案则都视为没有答案,请知晓;PPT和DOC文档可被视为“模板”,允许上传人保留章节、目录结构的情况下删减部份的内容;PDF文档不管是原文档转换或图片扫描而得,本站不作要求视为允许,下载前自行私信或留言给上传者【自信****多点】。
5、本文档所展示的图片、画像、字体、音乐的版权可能需版权方额外授权,请谨慎使用;网站提供的党政主题相关内容(国旗、国徽、党徽--等)目的在于配合国家政策宣传,仅限个人学习分享使用,禁止用于任何广告和商用目的。
6、文档遇到问题,请及时私信或留言给本站上传会员【自信****多点】,需本站解决可联系【 微信客服】、【 QQ客服】,若有其他问题请点击或扫码反馈【 服务填表】;文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“【 版权申诉】”(推荐),意见反馈和侵权处理邮箱:1219186828@qq.com;也可以拔打客服电话:4008-655-100;投诉/维权电话:4009-655-100。