鹰嘴豆抗氧化肽的分离纯化、鉴定及其抗氧化活性_梁雪荣.pdf
《鹰嘴豆抗氧化肽的分离纯化、鉴定及其抗氧化活性_梁雪荣.pdf》由会员分享,可在线阅读,更多相关《鹰嘴豆抗氧化肽的分离纯化、鉴定及其抗氧化活性_梁雪荣.pdf(8页珍藏版)》请在咨信网上搜索。
1、生物工程 食品科学 2023,Vol.44,No.04 209鹰嘴豆抗氧化肽的分离纯化、鉴定及其抗氧化活性梁雪荣,路振康,毛晓英*,吴庆智,张 建(石河子大学食品学院,新疆 石河子 832000)摘 要:以发芽鹰嘴豆为原料,制备鹰嘴豆抗氧化肽,采用葡聚糖凝胶对其进行分离纯化,通过测定自由基清除能力、还原力、脂质氧化抑制能力、对自由基诱导的蛋白质和DNA损伤的保护能力评价纯化肽的抗氧化活性。对纯化肽进行鉴定合成以验证其抗氧化活性,并对合成多肽进行安全性预测。结果表明,纯化后的多肽有较好的自由基清除能力、还原力,且对亚油酸自氧化有明显的抑制作用,对自由基诱导的蛋白质和DNA损伤有保护作用。经预测,
2、合成多肽无毒性与致敏性。综上,发芽鹰嘴豆水解物具有抗氧化能力,可用来制备抗氧化肽,从而增加鹰嘴豆的利用价值。关键词:抗氧化肽;自由基清除活性;氧化损伤保护;鉴定;合成Purification,Identification and Antioxidant Activity of Antioxidant Peptides from Chickpea Protein HydrolysateLIANG Xuerong,LU Zhenkang,MAO Xiaoying*,WU Qingzhi,ZHANG Jian(College of Food Science,Shihezi University,Sh
3、ihezi 832000,China)Abstract:Inthisstudy,anantioxidantpeptidewaspurifiedfromtheproteinhydrolysateofgerminatedchickpeabySephadexcolumnchromatography,anditsantioxidantactivitieswereevaluatedbydeterminingfreeradicalscavengingcapacity,reducingpower,lipidoxidationinhibitoryeffectandprotectiveeffectagainst
4、freeradical-induceddamagetoproteinsandDNA.Thepurifiedpeptidewasidentifiedandsynthesizedtoverifyitsantioxidantactivities,andthesafetyofthesyntheticpeptidewaspredicted.Theresultsshowedthattheantioxidantpeptidehadgoodfreeradicalscavengingabilityandreducingpower,significantlyinhibitedtheautooxidationofl
5、inoleicacid,andprotectedagainstproteinandDNAdamageinducedbyfreeradicals.Itwaspredictedthatthesyntheticpeptidehadnotoxicityorallergenicity.Inconclusion,theproteinhydrolysateofgerminatedchickpeahasantioxidantcapacityandcanbeusedtoprepareantioxidantpeptides,whichwillimprovetheutilizationvalueofchickpea
6、.Keywords:antioxidantpeptides;freeradicalscavengingactivity;protectionagainstoxidativedamage;identification;synthesisDOI:10.7506/spkx1002-6630-20211214-165中图分类号:TS214.9 文献标志码:A 文章编号:1002-6630(2023)04-0209-08引文格式:梁雪荣,路振康,毛晓英,等.鹰嘴豆抗氧化肽的分离纯化、鉴定及其抗氧化活性J.食品科学,2023,44(4):209-216.DOI:10.7506/spkx1002-6630-
7、20211214-165.http:/LIANG Xuerong,LU Zhenkang,MAO Xiaoying,et al.Purification,identification and antioxidant activity of antioxidant peptides from chickpea protein hydrolysateJ.Food Science,2023,44(4):209-216.(in Chinese with English abstract)DOI:10.7506/spkx1002-6630-20211214-165.http:/收稿日期:2021-12-
8、14第一作者简介:梁雪荣(1997)(ORCID:0000-0002-3014-5505),女,硕士,研究方向为植物蛋白及功能性食品。E-mail:*通信作者简介:毛晓英(1976)(ORCID:0000-0001-8773-2172),女,教授,博士,研究方向为植物蛋白及功能性食品。E-mail:自由基的过度产生会导致氧化应激,破坏DNA、蛋白质和脂质并中断各种生理功能,引起多种慢性疾病,甚至产生急性氧中毒导致生命危险1。此外,过多的自由基会产生氧化作用,这可能会降低食品的质量,缩短食品的保质期2。合成抗氧化剂(叔丁基对苯二酚、没食子酸丙酯和丁基羟基茴香醚等)可有效控制食物营养物210 20
9、23,Vol.44,No.04 食品科学 生物工程质的氧化。此外,膳食中摄入的抗氧化剂也可以降低与氧化应激相关的慢性疾病风险3。然而,合成抗氧化剂具有损伤DNA和潜在毒性风险的缺点。因此,近年来,从天然来源中寻找新的、安全的抗氧化剂,用于食品 和医药材料,以取代合成抗氧化剂,引起了人们极大的兴趣4。值得注意的是,源自植物蛋白的天然抗氧化肽因其环保、可持续、无毒副作用等优点而受到广泛关注5。近年来,人们从植物蛋白如鹰嘴豆等各种生物资源中鉴定并表征了具有更多营养价值的生物活性肽。鹰 嘴 豆(C i c e r a r i e t i n u m L.)为 豆 科(Leguminosae)重要作物,
10、是世界上仅次于大豆和豌豆的第3大重要谷物豆类,主要用作人类食物来源,它是植物蛋白最经济的来源之一6。鹰嘴豆蛋白被认为是良好的膳食蛋白质来源,是因为其氨基酸组成平衡、蛋白质生物利用度高7。鹰嘴豆蛋白水解物具有多种生物活性,包括抗氧化、抗菌、血管紧张素转换酶抑制和降血脂等8-9。学者们通过酶解鹰嘴豆蛋白制备了多种生物活性肽,其中以具有抗氧化活性的肽研究报道 较多5,7。因此,有关鹰嘴豆抗氧化肽的研究已成为当前一个研究热点。然而,鹰嘴豆的高营养价值通常会受到一些抗营养因子的影响,如胰蛋白酶抑制剂、单宁、植酸和皂苷等10。发芽可以改善鹰嘴豆粉的功能特性和鹰嘴豆分离蛋白的抗氧化特性,并显著减少其抗营养
11、因子11-12。因此,在这项工作中,以发芽鹰嘴豆为原料,制备了鹰嘴豆抗氧化肽,采用葡聚糖凝胶对其进行分离纯化,通过测定各种自由基清除能力、还原力、脂质氧化抑制能力、对自由基诱导的蛋白质和DNA损伤的保护能力评价纯化肽的抗氧化活性。并且对纯化肽通过鉴定合成验证了其抗氧化活性。最后对抗氧化肽进行安全性预测,为开发具有抗氧化功能的鹰嘴豆抗氧化肽提供理论依据。1 材料与方法1.1 材料与试剂鹰嘴豆(卡布里型)产自新疆木垒县;pBR322质粒DNA 上海保藏生物技术中心;牛血清白蛋白(bovine albumin,BSA)、碱性蛋白酶(酶活力2.0105 U/g)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1
12、-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)、2,2-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺盐(2,2-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid),ABTS)、2,2-偶氮二异丁基脒二盐酸盐(2,2-azo-bis(2-methylpropionamide)-dihydrochloride,AAPH)、SephadexG-75 北京索莱宝科技有限公司;乙腈、甲醇、甲酸、三氟乙酸(均为色谱纯)美国Sigma公司;其他试剂均为分析纯。1.2 仪器与设备DBS-100蛋白质纯化系统 上海青浦沪西分析仪器厂有限公司;高速
13、冷冻离心机 赛默飞世尔科技(中国)有限公司;多功能酶标仪 美国Thermo公司;SCIENTZ-18N型真空冷冻干燥机 宁波新芝生物科技股份有限公司;L-8900型高速氨基酸分析仪 日本日立有限公司;LC-2010A HT型液相色谱仪 日本岛津公司;毛细管高效液相色谱仪、电喷雾-组合型离子阱Orbitrap质谱仪 美国Thermo公司。1.3 方法1.3.1 鹰嘴豆多肽的制备将挑选好的鹰嘴豆先浸泡12 h,然后在室温下每隔6 h喷水,使其发芽23 d,芽长达到23 cm左右,制备发芽鹰嘴豆。以发芽鹰嘴豆为原料,采用低温烘干,经高速粉碎机粉碎,过60 目筛,制备发芽鹰嘴豆粉,脱脂后于4 贮存备用
14、。发芽鹰嘴豆蛋白的制备参考FengLi等13的方法并作修改。将发芽鹰嘴豆粉与水以一定的比例混合,用0.5 mol/L NaOH溶液调节pH值至9,搅拌1 h,4 000g离心10 min,所得沉淀重复提取2 次。将3 次上清液混合,用0.5 mol/L HCl溶液调节pH 4.3,8 000g离心10 min,用蒸馏水洗涤沉淀,并将所得蛋白浆pH值调节至7.0,冷冻干燥48 h即为鹰嘴豆蛋白,20 贮存备用。鹰嘴豆多肽的制备参考YangJing等14的方法并作修改。根据前期实验结果得出,采用碱性蛋白酶按照底物质量浓度2g/100 mL、酶用量8 000 U/g、pH 8.0、温度50、酶解时间
15、60 min的条件进行酶解,酶解之后,90 水浴10 min进行灭酶,7 000g离心10 min,收集上清液并冷冻干燥,20 贮存备用。1.3.2 鹰嘴豆多肽基本成分及氨基酸的测定水分含量测定:直接干燥法(GB 5009.32016食品中水分的测定);蛋白质含量测定:凯氏定氮法(GB 5009.52016食品中蛋白质的测定);脂肪含量测定:索氏提取法(GB 5009.62016食品中脂肪的测定);灰分含量测定:灰化法(GB 5009.42016食品中灰分的测定)。使用L8900高速氨基酸分析仪进行氨基酸分析。每个样品在110 用密封和真空玻璃管中的6 mol/L HCl溶液水解24 h。消化
16、后的样品定容至25 mL容量瓶。取5 mL消化液于60 干燥,并用醋酸钠缓冲溶液(pH 6.4)稀释。氨基酸组成分析结果以mg/g表示。1.3.3 凝胶色谱法分离抗氧化肽抗氧化肽的分离参照LiuJingbo等15的方法,稍作修改。将鹰嘴豆蛋白水解物以30mg/mL的质量浓度溶解在超纯水中,然后将3 mL样品加入SephadexG-75柱(1.6 cm50 cm),用超纯水预平衡。将流速调整为生物工程 食品科学 2023,Vol.44,No.04 2110.5 mL/min,每3.5 min将洗脱液收集到管中,280 nm波长处测定吸光度绘制峰形图。收集出峰组分,冷冻干燥后测定抗氧化活性,并选取
17、活性最高的组分用于后续分析。1.3.4 鹰嘴豆纯化肽分子质量分布的测定参照Yu Yihan等16的方法,略有修改。使用LC-2010A HT型液相色谱议(配有紫外检测器);色谱条件:TSKgel2000SWXL300mm7.8 mm色谱柱;流动相:乙腈-水-三氟乙酸(45 55 0.1,V/V);紫外检测波长220 nm;流速0.5 mL/min;柱温25;进样量10L。分子质量校正曲线所用标准品(mw):细胞色素C(12 327),抑肽酶(6 511),杆菌肽(1 421),Gly-Gly-Gly(189)。以标准品的lgmw及洗脱时间作标准曲线(y0.234 3x6.721 3,R2=0.
18、991 6)。1.3.5 纯化肽抗氧化活性的测定分别参考文献17-20的方法测定样品的DPPH自由基、ABTS阳离子自由基、羟自由基清除活性及还原力(A700 nm)。1.3.6 纯化肽脂质氧化抑制能力的测定根据WangJingyun等21的方法测定脂质氧化抑制能力,略有改动。亚油酸乳化液配制:0.28g亚油酸,0.028g吐温20,用磷酸盐缓冲液(0.2 mol/L,pH 7.2)定容至50 mL。配制不同质量浓度纯化的肽液,并以谷胱甘肽(glutathione,GSH)溶液为对照组。将2.0 mL无水乙醇、5.0 mL亚油酸乳化液、4.0 mL 0.2 mol/L磷酸盐缓冲液与4.0 mL
19、不同质量浓度肽液或GSH溶液混合。采用硫氰酸铁法测定过氧化值:0.1 mL混合溶液与体积分数75%的乙醇溶液、0.1 mL硫氰酸铵溶液(30%)、0.1 mL FeCl2溶液(0.02 mol/L;3.5%HCl溶液配制)反应3 min,在500 nm波长处测吸光度,记为 A样品0 h,间隔144 h后测吸光度,记为A样品144 h。空白对照:用去离子水代替肽液重复上述步骤测定吸光度,记为A空白0 h,间隔144 h后测吸光度,记为A空白144 h。脂质氧化抑制率按下式计算:脂质氧化抑制率/%=(1-)100A样品144 h-A样品0 hA空白144 h-A空白0 h1.3.7 纯化肽对AAP
20、H诱导蛋白质损伤的保护能力参照张亮亮等22方法并略作修改。实验组为0.4 mL 5mg/mL的BSA溶液,加入0.2 mL 80 nmol/L的AAPH作为氧化剂氧化BSA,构建蛋白质氧化体系,加入0.4 mL不同质量浓度(1、3、5mg/mL)纯化肽液作为抗氧化剂。以BSA加磷酸盐缓冲液(0.2 mol/L,pH 7.2)为空白组,以磷酸盐缓冲液代替抗氧化剂为损伤组。将每组分别混合后,在37 孵育24 h后,用0.02%的2,6-二叔丁基对甲基苯酚加入混合液终止反应。样品通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行验证。使用软件Quantity One 4.6.2(Bio-Rad,美国)测量B
21、SA条带的相对强度。1.3.8 纯化肽对羟自由基诱导的DNA损伤的保护作用参照WangJingyun等21方法并略作修改。羟自由基由Funton反应生成:取2.5LpBR322质粒DNA,依次加入1.25L6mmol/L FeSO4溶液,1.25L6mmol/L H2O2溶液,2.5L不同质量浓度(1、3、5mg/mL)纯化肽液在37 孵育30 min,立即加入10DNALoadingBuffer结束反应。空白组为pBR322质粒DNA加磷酸盐缓冲液(50 mmol/L,pH 7.0),损伤组以磷酸盐缓冲液代替肽液。混合物在1%琼脂糖凝胶上电泳。电泳后,染色30 min,用凝胶成像仪进行成像。
22、软件Quantity One 4.6.2用于测定超螺旋DNA条带的相对强度。1.3.9 基于液相色谱-串联质谱(liquidchromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)法鉴定抗氧化肽委托北京百泰派克生物科技有限公司完成其结构鉴定。采用Nanoflow-UPLC(Ultimate 3000系统)色谱仪。色谱条件:纳米柱:150m15 cm自制柱,填充反相ReproSil Pur C18-AQ树脂(1.9m,100,Dr.Maisch GmbH,德国);流动相:A为0.1%甲酸溶液,B为乙腈(含0.1%甲酸)。梯度洗脱:05 min,94%91
23、%A、6%9%B;520 min,91%86%A、9%1 4%B;2 0 5 0 m i n,8 6%7 0%A、14%30%B;5058 m i n,70%6 0%A、3 0%4 0%B;5 8 6 0 m i n,6 0%5%A、40%95%B。流速600 nL/min,进样量5L。质谱条件:喷淋电压2.2kV,毛细管温度270。利用Byonic对原始MS文件进行分析,并根据样本种类对目标蛋白数据库进行检索。只有高置信度鉴定肽被选择用于下游蛋白质鉴定分析。1.3.10 抗氧化肽的合成委托生工生物工程(上海)股份有限公司用固相肽合成法合成(合成多肽纯度95%)。并评估了合成肽的DPPH自由基
24、、ABTS阳离子自由基、羟自由基清除活性及还原力。1.3.11 抗氧化肽的致敏性与毒性预测多肽的致敏性预测采用AlgPred(https:/webs.iiitd.edu.in/raghava/algpred2/index.html),预测方法基于氨基酸组成的SVM模型;毒性预测采用ToxinPred(https:/webs.iiitd.edu.in/raghava/toxinpred/design.php),预测方法基于Swiss-Prot23。1.4 数据处理与统计分析所有实验重复3 次,结果用 s表示。使用OriginProgram9.5对数据进行分析作图。SPSS 20.0软件单因素方差
25、分析对数据进行显著性分析,检验水准=0.05,P0.05具有统计学差异。212 2023,Vol.44,No.04 食品科学 生物工程2 结果与分析2.1 鹰嘴豆抗氧化肽基本成分及氨基酸组成根 据 前 期 多 肽 制 备 的 最 佳 条 件 得 多 肽 得 率 为55.07%,此时,多肽DPPH自由基清除率为43.71%。从 表1可以看出,鹰嘴豆多肽含有较高的蛋白质含量和较低的脂肪含量。表 1 鹰嘴豆多肽基本成分Table 1 Basic components of antioxidant peptide derived from chickpea 成分水分蛋白质灰分脂肪质量分数/%11.18
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 鹰嘴豆 氧化 分离 纯化 鉴定 及其 活性 梁雪荣
1、咨信平台为文档C2C交易模式,即用户上传的文档直接被用户下载,收益归上传人(含作者)所有;本站仅是提供信息存储空间和展示预览,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对上载内容不做任何修改或编辑。所展示的作品文档包括内容和图片全部来源于网络用户和作者上传投稿,我们不确定上传用户享有完全著作权,根据《信息网络传播权保护条例》,如果侵犯了您的版权、权益或隐私,请联系我们,核实后会尽快下架及时删除,并可随时和客服了解处理情况,尊重保护知识产权我们共同努力。
2、文档的总页数、文档格式和文档大小以系统显示为准(内容中显示的页数不一定正确),网站客服只以系统显示的页数、文件格式、文档大小作为仲裁依据,平台无法对文档的真实性、完整性、权威性、准确性、专业性及其观点立场做任何保证或承诺,下载前须认真查看,确认无误后再购买,务必慎重购买;若有违法违纪将进行移交司法处理,若涉侵权平台将进行基本处罚并下架。
3、本站所有内容均由用户上传,付费前请自行鉴别,如您付费,意味着您已接受本站规则且自行承担风险,本站不进行额外附加服务,虚拟产品一经售出概不退款(未进行购买下载可退充值款),文档一经付费(服务费)、不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
4、如你看到网页展示的文档有www.zixin.com.cn水印,是因预览和防盗链等技术需要对页面进行转换压缩成图而已,我们并不对上传的文档进行任何编辑或修改,文档下载后都不会有水印标识(原文档上传前个别存留的除外),下载后原文更清晰;试题试卷类文档,如果标题没有明确说明有答案则都视为没有答案,请知晓;PPT和DOC文档可被视为“模板”,允许上传人保留章节、目录结构的情况下删减部份的内容;PDF文档不管是原文档转换或图片扫描而得,本站不作要求视为允许,下载前自行私信或留言给上传者【自信****多点】。
5、本文档所展示的图片、画像、字体、音乐的版权可能需版权方额外授权,请谨慎使用;网站提供的党政主题相关内容(国旗、国徽、党徽--等)目的在于配合国家政策宣传,仅限个人学习分享使用,禁止用于任何广告和商用目的。
6、文档遇到问题,请及时私信或留言给本站上传会员【自信****多点】,需本站解决可联系【 微信客服】、【 QQ客服】,若有其他问题请点击或扫码反馈【 服务填表】;文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“【 版权申诉】”(推荐),意见反馈和侵权处理邮箱:1219186828@qq.com;也可以拔打客服电话:4008-655-100;投诉/维权电话:4009-655-100。