在线固相萃取-高效液相色谱...定植物中11种水溶性有机酸_战楠.pdf
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1、256 2023,Vol.44,No.04 食品科学 成分分析在线固相萃取-高效液相色谱-高分辨质谱法 测定植物中11 种水溶性有机酸战 楠1,孙 青1,郝瑞霞2,郭 峰1,*(1.国家地质实验测试中心,自然资源部生态地球化学重点实验室,北京 100037;2.北京大学地球与空间科学学院,北京 100871)摘 要:采用在线固相萃取-高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱建立植物中11 种水溶性有机酸(乳酸、富马酸、琥珀酸、苹果酸、酒石酸、香豆酸、没食子酸、柠檬酸、香草酸、阿魏酸、新绿原酸)的分析方法。样品经匀浆、超声、过滤、稀释后,经在线Oasis MAX柱(20 mm2.1 mm,3
2、0m)富集净化,采用BEHC18 AX色谱柱(100 mm2.1 mm,1.7m)分离,以含10 mmol/L甲酸铵的0.9%甲酸和0.9%甲酸-乙腈为流动相,梯度洗脱。在负离子扫描模式下,以Full MS/dd-MS2模式进行分析,内标法定量。结果表明,11 种有机酸可在9 min内完成分离分析,各组分的精确质量数偏差小于5.00106,在1100g/L质量浓度范围内线性关系良好,相关系数(R2)大于0.999,方法检出限为0.13.2 g/kg,定量限为0.39.6 g/kg。以芡实和小白菜为基质样品,在2 个不同加标水平下,11 种有机酸的平均添加回收率分别为92.2%111%和94.2
3、%110%,日内相对标准偏差分别为1.4%4.9%和0.8%5.6%。所建方法简便、快速、准确、可靠,已应用于8 种植物(白萝卜、胡萝卜、土豆、小白菜、香蕉、鸭梨、葡萄、芡实)中有机酸含量的分析,可以作为快速分析植物中水溶性有机酸的新方法。关键词:有机酸;在线固相萃取;高效液相色谱;高分辨质谱;植物Determination of 11 Water-Soluble Organic Acids in Plants by Online Solid-Phase Extraction Coupled with High Performance Liquid Chromatography-High Re
4、solution Mass SpectrometryZHAN Nan1,SUN Qing1,HAO Ruixia2,GUO Feng1,*(1.Key Laboratory of Eco-Geochemistry,Ministry of Natural Resources,National Research Center for Geoanalysis,Beijing 100037,China;2.School of Earth and Space Sciences,Peking University,Beijing 100871,China)Abstract:An analytical me
5、thod for the determination of 11 water-soluble organic acids(lactic acid,fumaric acid,malic acid,tartaric acid,coumaric acid,gallic acid,citric acid,vanillic acid,ferulic acid,and neochlorogenic acid)in plants by online solid-phase extraction(SPE)coupled with high performance liquid chromatography-q
6、uadrupole orbitrap high resolution mass spectrometry(HPLC-Q-Orbitrap-HRMS)was developed.Samples were homogenized,ultrasonically extracted,filtrated,diluted,and purified on an Oasis MAX column(20 mm 2.1 mm,30 m).The analytes were separated on separated on a BEH C18 AX column(100 mm 2.1 mm,1.7 m)by gr
7、adient elution using a mobile phase consisting of 0.9%formic acid solution containing 10 mmol/L ammonium formate and 0.9%formic acid in acetonitrile.The MS analysis was performed by full MS/dd-MS2 scanning in the negative ion mode.Quantitation was performed using the internal standard method.Under t
8、he optimum conditions,the 11 organic acids were well separated within 9 minutes,and the accurate mass deviation for each compound was less than 5.00 10-6.The developed method showed good linearity in the range of 1100 g/L with correlation coefficients(R2)greater than 0.999.The limits of detection(LO
9、D)and quantification(LOQ)ranged from 0.1 to 3.2 g/kg and from 0.3 to 9.6 g/kg,respectively.The average recoveries of the 11 organic acids in Euryale ferox seeds and pakchoi spiked at two concentration levels were 92.2%111%and 94.2%110%with 收稿日期:2022-03-28基金项目:中国地质调查局地质调查二级项目(DD20211414);国家自然科学基金面上项目
10、(21976044);中央级公益性科研院所基本科研业务费专项(CSJ-2022-05)第一作者简介:战楠(1988)(ORCID:0000-0002-1204-5535),女,助理研究员,硕士,研究方向为环境化学、有机地球化学。E-mail:*通信作者简介:郭峰(1982)(ORCID:0000-0001-8074-201X),女,研究员,博士,研究方向为有机污染物的分析方法开发与生态健康风险评价。E-mail:成分分析 食品科学 2023,Vol.44,No.04 257intraday relative standard deviations(RSDs)of 1.4%4.9%and 0.8
11、%5.6%,respectively.The method was successfully applied to the analysis of organic acids in white radish,carrot,potato,pakchoi,banana,pear,grape,and E.ferox seeds.This method is simple,fast,accurate,and reliable,and can be used as a new approach for the rapid analysis of water-soluble organic acids i
12、n plants.Keywords:organic acids;online solid-phase extraction;high performance liquid chromatography;high resolution mass spectrometry;plants DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220328-345中图分类号:TS207.3 文献标志码:A 文章编号:1002-6630(2023)04-0256-09引文格式:战楠,孙青,郝瑞霞,等.在线固相萃取-高效液相色谱-高分辨质谱法测定植物中11 种水溶性有机酸J.食品科学,2023,44(4
13、):256-264.DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220328-345.http:/ZHAN Nan,SUN Qing,HAO Ruixia,et al.Determination of 11 water-soluble organic acids in plants by online solid-phase extraction coupled with high performance liquid chromatography-high resolution mass spectrometryJ.Food Science,2023,44(4):256-264.
14、(in Chinese with English abstract)DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220328-345.http:/有机酸广泛分布于植物的根、茎、叶、果实等部位,对于维持植物自身的新陈代谢具有重要作用:植物根系通过分泌有机酸影响周围土壤和矿物中元素的释放,改善根系环境,增强对环境的适应能力;植物茎和叶通过分泌有机酸参与植物光合作用、呼吸作用等过程,促进植物生长;植物果实中积累的有机酸不仅与其风味、色泽密切相关,同时也是判断果实成熟度的重要指标1-3。植物中的一些天然有机酸具有疾病预防和维护人体健康的功效。例如,柠檬酸和苹果酸能促进体内三羧酸循环,帮助营
15、养元素吸收、提升人体新陈代谢速 度2-3;没食子酸具有抑菌、抗炎、抗氧化等生理学活性,可帮助调节肠道菌群组成4;琥珀酸具有抑菌、镇静、止血的功效,可增强人体免疫力5。目 前,有 机 酸 的 分 析 方 法 主 要 包 括 气 相 色 谱(gas chromatography,GC)和气相色谱-质谱(gas chromatography mass spectrometry,GC-MS)法6-8、离子色谱(ion chromatography,IC)法9-11、高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)法和高效液相色谱-质谱(high p
16、erformance liquid chromatography-mass spectrometry,HPLC-MS)法12-19。GC主要用于测定低分子质量、易挥发的有机酸,对于沸点较高的有机酸通常需要衍生化处理,但衍生化过程会增加操作难度和前处理时间,并且可能导致误差加剧,从而限制了GC和GC-MS法的应用6-8。IC9-11和HPLC12,14-16 是有机酸分析最常用的方法,但非特异性检测器易受到样品基质的干扰,因此对于基质复杂的样品,往往需要采用相对复杂的前处理去除干扰,以保证分析的灵敏度和准确度。质谱具有高选择性、高灵敏度等优点,可弥补HPLC定性能力不足的缺点,HPLC-MS也因
17、此成为目前公认的有机酸高效检测方法13,17-19,并被2021年最新发布的有机酸国家标准所选用19。近年来,高分辨质谱以其精准识别、精确定量的技术优势,在食品分析领域受到了越来越多的关注。Scordo等20利用液相色谱-四极杆-离子阱高分辨质谱建立了测定草莓和橄榄中全氟烷基酸的分析方法,为有机酸的分析提供新思路。大多数低分子质量的天然有机酸易溶于水,因此通常采用水、甲醇、乙醇等溶剂或混合溶剂提取植物中的有机酸2,10,12,19-22。如今,除了常规的蒸馏法2-3、超声提取法3、液液萃取法3,14、固相萃取(solid-phase extraction,SPE)法3,7,23外,一些新型前处
18、理技术如固相微萃取8、基质固相分散萃取24、QuEChERS法20也开始应用于有机酸的提取。在线固相微萃取是一种可与仪器连接的在线全自动前处理技术,它与HPLC-MS联用时,可通过柱切换实现样品的自动富集、纯化、洗脱和分离分析,简化前处理程序,提高分析效率25-26。迄今,在线SPE与HPLC-MS联用技术已成功地应用于食品和环境领域有机污染物的分析26-29,但相关技术对于有机酸的分析鲜有报道。本研究采用在线SPE技术结合高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱(high performance liquid chromatography-quadrupole orbitrap high
19、 resolution mass spectrometry,HPLC-Q-Orbitrap-HRMS)技术,建立一种快速测定植物中11 种水溶性有机酸的新方法。方法简单、快速、精准、可靠、自动化程度高,适用于植物中有机酸类化合物的批量分析。1 材料与方法1.1 材料与试剂甲醇、乙腈(均为色谱纯)德国Merk公司;258 2023,Vol.44,No.04 食品科学 成分分析甲酸(LC-MS级),有机酸标准品:L-乳酸、香豆酸、没食子酸、柠檬酸、香草酸、阿魏酸、新绿原酸(纯度均大于98%)上海安谱实验科技股份有限公司;甲酸铵(分析纯)美国Fisher Chemical公司;富马酸、琥珀酸、L-苹
20、果酸、DL-酒石酸(纯度均大于98%)德国Dr.Ehrenstorfer GmbH公司;内标:柠檬酸2,2,4,4-D4(99%)加拿大CDN公司;实验用水为超纯水(18.2Mcm)。1.2 仪器与设备HPLC-Q-Orbitrap-HRMS联用仪Q Extractive(配备DGP-3600RS双梯度快速分离泵、自动在线SPE系统及Xcalibur数据处理系统)美国Thermo Fisher公司;A11-研磨机 德国IKA公司;THC-超声波提取器 济宁天华超声电子仪器有限公司;3-15型高速离心机 德国Sigma公司;Milli-Q超纯水机 美国Millipore 公司;PremierBE
21、HC18 AX色谱柱(100 mm2.1 mm,1.7m)、Oasis MAX在线SPE柱(20 mm2.1 mm,30m)美国Waters公司;0.22m亲水性尼龙滤膜 上海安谱实验科技有限公司。1.3 方法1.3.1 溶液配制内标溶液:准确称取10.00 mg内标物,用甲醇定容至10 mL,配制成1 000 mg/L内标储备液,于4 密封贮存。使用前,用甲醇-水(1 1,V/V)稀释内标储备液,配成10.0 mg/L内标溶液。有机酸标准溶液:分别称取11 种有机酸单一标准品各10.00 mg,用甲醇-水(1 1,V/V)定容至10 mL,配制成1 000 mg/L有机酸混合标准储备液,于4
22、 密封储存。空白标准工作溶液:用甲醇-水(1 1,V/V)将混合标准储备液逐级稀释,配制成质量浓度为1、2、5、10、20、50、100g/L的空白标准工作溶液,同时加入内标溶液,使内标质量浓度为1.0 mg/L。基质标准工作溶液:小白菜和芡实样品溶液,稀释100 倍后,配制质量浓度为1、2、5、10、20、50、100g/L的基质标准工作溶液,同时加入内标溶液,使内标质量浓度为1.0 mg/L。1.3.2 样品前处理以白萝卜、胡萝卜、土豆、小白菜、香蕉、苹果、葡萄、芡实作为植物根、茎、叶、果实、种子的代表性样品进行实验。前7 种样品采购自北京某超市,新鲜芡实采摘自苏州芡实种植基地。取适量样品
23、洗净、去核、切块,放入研磨机中制成匀浆。称取2.00 g匀浆液于离心管,加入18 mL甲醇-水(1 1,V/V),涡旋振荡后,超声提取15 min,5 000 r/min 离心5 min,取上清液,过0.22m亲水滤膜,滤液用超纯水稀释数倍后,加入内标溶液,待上机分析。1.3.3 仪器分析条件在线SPE与HPLC-MS/MS联用系统示意图如图1所示。废液右泵左泵在线固相萃取柱自动进样器样品环分析柱MS检测器图 1 在线SPE-HPLC-MS/MS质谱分析系统示意图Fig.1 Schematic diagram of online SPE-HPLC-Q-Orbitrap-HRMS system1
24、.3.4 在线SPE条件通过HPLC系统进行自动在线SPE,左泵为样品富集泵,右泵为分析泵。具体参数见表1。预处理的样品在左泵流动相的带动下,经Oasis MAXSPE柱在线富集,以0.50 mL/min流速等梯度洗脱,清洗2.0 min后,六通阀与分析柱连通,右泵流动相将目标组分及内标物洗脱至BEHC18 AX分析柱,洗脱4.5 min后,六通阀自动切换回初始位置,左泵进行在线SPE柱再生。与此同时,右泵流路进行目标组分的分离和质谱检测。表 1 在线SPE及HPLC条件参数Table 1 Mobile phase parameters for online SPE and HPLC时间/mi
25、n左泵时间/min右泵流动相A体积分数/%流动相B体积分数/%流速/(mL/min)流动相A体积分数/%流动相B体积分数/%流速/(mL/min)010000.50010000.252.010000.502.010000.254.010000.502.540600.255.001000.504.040600.256.501000.506.540600.257.010000.507.010000.259.010000.509.010000.251.3.5 色谱条件PremierBEHC18 AX色谱柱(100 mm2.1 mm,1.7m);柱温35,进样量1.0 mL,流速0.25 mL/min
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