乙酰基转移酶抑制剂对食管癌...水平及细胞增殖和迁移的影响_梁宗英.pdf
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1、论著基础研究 :网络首发 :()乙酰基转移酶抑制剂对食管癌细胞、乙酰化水平及细胞增殖和迁移的影响梁宗英,杨阳,郑竞雄,赵宝山,侯继申,孙光蕊(承德医学院附属医院胸外科,河北承德 ;河北省胸科医院临床实验室,石家庄 )摘要目的探讨乙酰基转移酶抑制剂 对食管癌 细胞乙酰基转移酶、乙酰化水平及细胞增殖和迁移的影响。方法 处理食管癌 细胞为实验组(组),有机溶剂 处理食管癌 细胞为对照组(组)。采用 法筛选并确定 最佳给药浓度,检测 表达,检测、细胞周期蛋白()、癌基因 ()、淋巴细胞瘤()和血管内皮生长因子()蛋白表达,免疫共沉淀检测 乙酰化水平,法检测细胞增殖情况,划痕修复实验检测迁移能力,小室实
2、验检测侵袭能力。结果 可浓度依赖性抑制食管癌 细胞增殖,其 ,确定 最佳给药浓度为 。组中 和蛋白表达较 组明显降低,差异有统计学意义()。组 乙酰化水平较 组明显下降,差异有统计学意义()。组肿瘤增殖相关蛋白 、和 蛋白表达,细胞的增殖能力、侵袭能力、迁移能力较 组明显降低()。结论 可能通过抑制乙酰基转移酶 的表达下调食管癌 细胞中 乙酰化水平,进一步抑制肿瘤增殖通路中相关蛋白表达,从而抑制食管癌细胞增殖、侵袭和迁移能力。关键词乙酰基转移酶抑制剂;乙酰化修饰 中图法分类号 文献标识码 文章编号 (),(.,;.,),()(),(),(),重庆医学 年月第 卷第期基金项目:河北省医学科学研究
3、重点课题计划项目();承德市科学技术研究与发展计划项目()。作者简介:梁宗英(),副主任医师,副教授,博士,主要从事表观遗传学中甲基化、乙酰化修饰在肺癌、食管癌中的分子机制研究。通信作者,:。();,(),;我国食管癌发病率和病死率均占世界范围内的 以上,极大地危害了居民健康。虽然手术切除、化疗及放疗等在一定程度上改善了食管癌患者的预后,但其总体生存率和生活质量仍较差。赖氨酸乙酰化是表观遗传学中蛋白质转录翻译后主要修饰方式之一,乙酰化修饰和其他修饰之间的交叉调节对转录控制和表观遗传程序至关重要。除组蛋白外,许多核蛋白和肿瘤相关蛋白也可以发生赖氨酸乙酰化修饰,并在肿瘤的发生和发展过程中起到关键性
4、作用。研究表明,赖氨酸乙酰化修饰需要乙酰基转移酶参与完成,作为一种经典乙酰基转移酶通过调控组蛋白和非组蛋白的乙酰化修饰参与多种肿瘤的发生和转移,但其在食管癌中相关蛋白乙酰化修饰中的作用尚无研究报道。是细胞内凋亡抑制家族中抗凋亡能力最强的蛋白之一,在多种肿瘤中呈高表达,参与了肿瘤的增殖、凋亡、侵袭及转移。前期研究显示,在食管癌组织及转移淋巴结中呈高表达并发生了乙酰化,且其高乙酰化水平与食管癌分期、组 织分 化 及 淋 巴 结 转 移 相 关。然 而,乙酰化促进食管癌发生及发展的具体机制尚不清楚。本研究观察乙酰基转移酶抑制剂 对食管癌细胞乙酰基转移酶、乙酰化水平及细胞增殖、侵袭及迁移的影响,探讨
5、与 乙酰化修饰可能存在的内在联系及在食管癌发生和发展中的作用机制。材料与方法材料人食管癌 细胞(中国科学院上海生命科学研究院细胞库);培养基、胎牛血清、胰蛋白酶消化液、基质胶(广州锐博 生物 科 技有 限 公司);蛋白凝胶电泳试剂盒、蛋白定量试剂盒、细胞裂解液、(北京碧云天生物科技有限公司);、乙酰基赖氨酸 、细胞周期蛋白 ()、癌基因 ()、淋巴细胞瘤()和血管内皮生长因子()单 克 隆 抗 体(英 国 公 司 或 美 国 公司);琼 脂糖珠(上 海 一 基 实 业 有 限 公司);和 (上海斯百全化学有限公司)。方法细胞培养和分组取冻存的人食管癌 细胞,水浴速溶,微量移液枪转入离心管内并加
6、含 培养基轻轻吸打混匀,常温离心;弃上清液,加 培养基吸打混匀后转入培养瓶;、孵箱培养,后换液并观察细胞生长情况,待细胞铺满培养瓶底部约 进行相关实验。处理食管癌 细胞为实验组(组),处理食管癌 细胞为对照组(组)。用胰蛋白酶消化对数生长期 细胞,以每孔 个细胞 的密度接种于 孔板,待细胞贴壁后加药处理,按照浓度梯度、处理,每组个平行孔。细胞处理 后进行 检测。每孔加入 (),培养箱孵育后终止培养,弃上清液,加入 后,酶标仪检测 处吸光度()值计算细胞增殖抑制率。计算药物对细胞生长的半数抑制浓度(),后续实验均以 值为细胞给药浓度。提取试剂盒提取总,取 ,应用 ,按说明书进行反转录为 。应用
7、荧光定量试剂盒检测 表达。反应条件:预变性 ,变性,退火,延伸(个循环)。溶解曲线参照仪器自动程序。使用 和 作为内参,相对表达量以 计算。提取细胞总蛋白,测定浓度;制备电泳蛋白上样液,行凝胶电泳。电泳后,转膜。加一抗 过夜。次日孵育二抗,重复洗膜后显影。采用 软件分析蛋白条带的积分光密度(值)。免疫共沉淀实验提取细胞总蛋白,测定浓度。加入目的蛋白纯抗体和 琼脂糖珠,混匀后裂解缓冲液补充至总体积 ,离心 后,取上清液 置入离心管,共沉淀。离心 ,弃上清液。裂解缓冲液 洗涤琼脂糖珠。离心 ,弃上清液。重复洗涤次。最后一次洗涤完毕后,弃去上清液。裂解缓冲液 和等体积的 上样缓冲液混合,煮沸后离心;
8、行 。取处于对数生长期的细胞,消化后离心收集细胞沉淀。以 培养基重悬,制成单细胞悬液。细胞计数后,以每孔 个细胞接种于 孔板,每孔加入重庆医学 年月第 卷第期 。常规培养至每孔细胞密度达到 进行转染。、后,每个时间点拿出一块板,每孔加入 液,继续常规孵育。离心,弃上清液。每孔加入 ,水平摇床 。酶标仪检测每孔的 处值,绘制细胞生长曲线。划痕修复实验收集细胞,胎牛血清的 培养基配成单细胞悬液;以每孔 个细胞接种到 孔板,每孔 。常规培养,待细胞铺满孔底,用 无菌移液枪头垂直板面划痕,用无血清的培养基将掉下来的细胞洗去。每孔加入无血清的培养基继续培养,倒置显微镜测量划痕的宽度。小室实验取转染后铺满
9、孔底细胞,用 不含 的胰蛋白酶消化为单细胞悬液,收集后计数细胞。将 小室按顺序放入 孔板,无菌镊子取出小室,室外加入含 血清 培养基 。小室内加入 细胞悬液(细胞数 个),培养液为不含血清的 培养基,每组细胞重复个标本。孔板放入 孵育箱内常规培养。取出小室,缓冲液淋洗次,用棉签擦去微孔膜内层细胞。多聚甲醛固定 ,结晶紫染色 。缓冲液涮洗次,每次更换液体;棉签擦干液体,显微镜下计数穿膜细胞数;每个小室随机计数 个视野。统计学处理采用 统计软件进行分析。计量资料以表示,两两比较采用检验,多组间比较采用单因素方差分析,以 为差异有统计学意义。结果 对食管癌 细胞活力的影响 可浓度依赖性抑制食管癌 细
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