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线粒体靶向抗氧化剂对尼古丁诱发大鼠心脏改变的影响_潘启民.pdf
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1、 基金项目:辽宁省科学技术计划项目,项目编号:。作者简介:潘启民(),男,辽宁鞍山人,副主任医师,硕士学位,主要研究方向为急慢性心功能障碍。通讯作者:刘叶(),女,辽宁锦州人,副教授,硕士学位,主要研究方向为心脏损伤与功能恢复。线粒体靶向抗氧化剂对尼古丁诱发大鼠心脏改变的影响潘启民,付国权,刘叶,马琳琳(锦州医科大学附属第一医院,辽宁 锦州;鞍山市第三医院,辽宁 鞍山)摘要:目的 观察白藜芦醇和 对尼古丁诱导的心脏重塑、氧化和炎症的影响,为开展线粒体途径预防和治疗心脏疾病提供研究数据。方法 大鼠每天给予 尼古丁,同时分别给予 或白藜芦醇或对照剂,连续 。收集各组大鼠心脏组织,分析心脏结构及参数
2、变化,检测线粒体、谷胱甘肽()和 活性水平,免疫组化法检测氧化应激标志物 硝基酪氨酸表达情况,最后采用分子生物学方法检测抗氧化基因、促肥厚基因、纤维化基因和炎症相关基因的表达情况。结果尼古丁导致大鼠心脏重量增加。心肌线粒体 和 硝基酪氨酸表达升高,的酶活性显著降低(),大鼠心脏氧化应激水平增加。基因表达分析显示,尼古丁使、和 的表达上调()。促炎因子 和 基因表达显著升高()。和白藜芦醇给药能够显著降低尼古丁诱导的心脏重量。同时降低了尼古丁诱导的线粒体 生成,降低 硝基酪氨酸和 的表达水平()。白藜芦醇可使大鼠心脏 活性显著提高()。同时降低尼古丁诱导的心肌细胞肥大以及 和 的基因表达()。白
3、藜芦醇还降低了尼古丁诱导的、表达上调()。可使大鼠 的基因表达明显下降()。结论 线粒体靶向抗氧化剂 或白藜芦醇能够影响线粒体活性氧生成并可部分减弱尼古丁诱导的心肌改变。关键词:白藜芦醇;心脏病;尼古丁;线粒体;氧化应激;免疫组化中图分类号:文献标志码:文章编号:(),(,;,):,(),(),()(),()(),(),锦州医科大学学报 ()DOI:10.13847/ki.lnmu.2023.01.003()():;吸烟是心血管疾病重要的风险因素之一。研究表明长期接触尼古丁会导致心肌细胞肥大和纤维化,而其诱发心血管疾病的重要机制是 生产及氧化应激。最近,研究证明线粒体可能会影响尼古丁诱导的心血
4、管疾病发生。然而,目前人们尚不清楚通过靶向抑制线粒体 的生成是否能阻止尼古丁诱导的心肌改变。是一种线粒体靶向超氧化物歧化酶()类似物,也是一种线粒体超氧化物的特异清除剂,通过调节线粒体 的产生而有效地减轻心血管疾病。白藜芦醇是一种天然的二苯乙烯,通常存在于红酒、葡萄、蓝莓中。研究已经证实白藜芦醇具有心脏保护作用。本研究我们拟采用线粒体 靶向抑制剂,用白藜芦醇作为对照观察其是否能有效地预防尼古丁诱导的氧化应激、炎症以及心肌改变。材料与方法 实验材料清洁级雄性 大鼠 只,周龄,购于锦州医科大学实验动物中心。大鼠自由进食和饮水。尼古丁、白藜芦醇、为 公司产品,兔抗 抗体、兔抗硝基酪氨酸抗体、二抗试剂
5、盒、血浆尼古丁 试剂盒购于北京博奥森生物公司,裂解试剂、试剂盒、荧光 探 针 为 公 司 产 品。设 备 有 显微镜、成像系统、微孔板酶标仪、无创血压检测系统、激光共聚焦显微镜。实验分组所有的大鼠(除对照组)通过腹腔注射尼古丁生理盐水()溶液,连续 。将大鼠随机分为 组,每组 只。()对照组():用无菌蒸馏水制备 溶液(,),大鼠每天分别注射 生理盐水和 溶液,连续 ;()尼古丁组():按照 剂量通过腹腔注射的尼古丁生理盐水溶液,连续 ;()尼古丁 组():溶于 中,按照 剂量每天通过腹腔注射给药,持续 ;()尼古丁白藜芦醇组():白藜芦醇溶解在 中,按照 剂量给予大鼠腹腔注射 。大鼠每隔 测
6、量 次收缩压()和心率。测量前所有大鼠在安静环境中适应 ,每天测 次,至少连续测量 后取平均值。时,通过大鼠眼眶窦出血法采集血液,使用 试剂盒检测血浆尼古丁水平。分离并收集各组大鼠心脏组织并称重。线粒体 产物的检测按照文献报道的方法从各组大鼠左心室心肌组织中分离出线粒体。将分离的线粒体重悬于含有 蔗糖、和 的缓冲液中。然后,在 下,谷氨酸和 苹果酸作为复合呼吸底物,将 分离的线粒体与线粒体硫氧化物荧光探针混合到一起,于暗室内孵育 。分别在 和 波长激发下使用微孔板酶标仪测量荧光强度。抗氧化水平测定将左心室心肌组织在冷的 缓冲液中匀浆,产生的上清液用于检测超氧化物歧化酶()活性。谷胱甘肽:首先用
7、 和谷胱甘肽()还原酶孵育,二硫代二(硝基苯甲酸)比色法测定总谷胱甘肽()水平。用 乙烯基吡啶衍生化后测定组织匀浆中 水平。水平由()值减去 值计算 组织学和免疫组织化学检测左室组织制成石蜡包埋块,行 厚度片,采用苏木精和伊红染色进行形态学观察;测量心肌细胞大小采用天狼猩红染色试剂进行染色,拍照并在显微图像中测量胶原密度。对于 染色,倍下选取 张独立视野图像,使用 软件每个动物测量 个心肌细胞的横截面积。对于胶原密度,使用 软件在 倍放大视野下选取 张图像进行测量。另外取左室切片,对氧化应激标志物 硝基酪氨酸进行免疫组化检测。脱蜡,用二甲苯和乙醇潘启民,等:线粒体靶向抗氧化剂对尼古丁诱发大鼠心
8、脏改变的影响复水。用 的柠檬酸钠缓冲液修复抗原。用 过氧化氢酶阻断内源性过氧化物酶活性,然后 血清阻断。切片与兔抗 硝基酪氨酸一抗()孵育,冰箱过夜。用 代替一抗作为阴性对照。孵育过夜后,在室温下用 标记二抗孵育 ,洗。苏木精复染细胞核,封片后 倍下获取图像,每只动物分别取 张切片使用 软件分析。基因表达分析使用 裂解试剂由左室组织中提取总。分别检测、促肥厚基因(、)、纤维化基因(、)、炎症相关基因(、。采用 试剂盒检测 氧化酶的 亚基。使用 序列检测软件,从 中生成引物序列,见表,对基因表达进行定量分析。用 方法检测,以核蛋白体 作为管家基因的相对倍率变化情况。统计学方法所有数据以平均值标准
9、差表示。采用单因素或双因素方差分析(),然后采用 检验分析组间差异,以 为有统计学意义。结 果 用药前后各组的心脏参数的变化结果 后,对照组在尼古丁给药后心脏重量、左心室重量显著增加,;然而,和白藜芦醇组均显著降低了尼古丁诱导的心脏重量、左心室重量。血浆尼古丁分析也显示,给药 后,、和 组的尼古丁摄入量相当,见表。与对照组相比,尼古丁给药后 大鼠收缩压()和心率升高,然而,和白藜芦醇均能显著消除尼古丁诱导的终末收缩压升高,;见图。和白藜芦醇对尼古丁给药大鼠的心率均无显著影响,见图。表 各种基因的引物序列基因名称引物序列()表 大鼠体重、器官重量和血浆尼古丁的终点分析(,)参数空白对照组体重()
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