我国部分地区土壤中绿僵菌的物种多样性_殷旭昱.pdf
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1、39(1)77-87 中国生物防治学报 Chinese Journal of Biological Control 2023 年 2 月 收稿日期:2021-12-17 基金项目:广州市科技计划项目(201903010067)作者简介:殷旭昱,硕士研究生,E-mail:;*通信作者,博士研究生,教授,博导,E-mail:。DOI:10.16409/ki.2095-039x.2022.07.005 我国部分地区土壤中绿僵菌的物种多样性 殷旭昱,方 康,胡琼波*(华南农业大学植物保护学院,广州 510642)摘要:绿僵菌是一种广泛存在且具有较高经济、生态价值的极具发展前景的绿色安全生物防治材料。为
2、了更好地了解我国绿僵菌资源的生物多样性,本研究从 13 个省份不同生境中采集土壤样品,采用选择培养的方法对绿僵菌菌株进行分离纯化,通过形态学、分子生物学获取其 ITS1 和 ITS4 序列等方法鉴定菌株。在用 MEGA 软件依据邻接法(NJ)构建基于绿僵菌菌株 ITS1 和 ITS4 序列的系统发育树并进行同源性分析的基础上,采用香农-威纳指数、优势度指数和均匀度指数评价其多样性。结果表明,在 607 份土壤样品中,分离出绿僵菌属真菌共计 222 株,其中优势菌种金龟子绿僵菌 Metarhizium anisopliae 130 株,优势度指数为 0.586;另有马昆德绿僵菌 Metarhiz
3、ium marquandii 83 株、黄绿绿僵菌 Metarhizium flavoviride 7 株、罗伯茨绿僵菌 Metarhizium robertsii 2 株。林地的香农-威纳指数最高,为 0.983,说明其物种丰富度最高。林地的均匀度指数最高,为 0.709,说明其不同种间分配最均匀。关 键 词:绿僵菌;昆虫病原真菌;生物多样性 中图分类号:S476.1 文献标识码:A 文章编号:1005-9261(2023)01-0077-11 Species Diversity of Metarhizium spp.in Soils from Areas of China YIN Xuyu
4、,FANG Kang,HU Qiongbo*(College of Plant Protection,South China Agricultural University,Guangzhou 510642,China)Abstract:Entomopathogenic fungi in the genus Metarhizium are a common and promising green biological control agent with high economic and ecological value.In order to determine the biodivers
5、ity of Metarhizium in China,the Metarhizium was isolated and purified by selective culture from soil samples collected from different habitats in Guangdong,Guangxi,Fujian,Guizhou,Yunnan,Sichuan,Tibet,Hubei,Hunan,Hainan,Hebei,Henan and Tianjin.The Metarhizium was identified by morphology and molecula
6、r biology using ITS1 and ITS4 sequences.Then the biodiversity was evaluated with the Shannon Weiner,Berger-Parker and Pielou on the basis of analysing the homology and constructing the phylogenetic tree of ITS1 and ITS4 sequences by Neighbor-Joining(NJ)method with MEGA.The result showed that 222 str
7、ains of Mertarhizium were isolated from 607 soil samples,among which there were 130 strains of M.anisopliae,which is the dominant species with a Berger-Parker value of 0.586,83 strains of M.marquandii,7 strains of M.flavoviride,and 2 strains of M.robertsii.The Shannon-Wiener of fallow land,farmland,
8、orchard,grassland,and woodland were 0.451,0.677,0.683,0.843,and 0.983,respectively,indicating that the wood land is of the highest species richness.And the Pielou of the above habitats were 0.325,0.488,0.493,0.608,and 0.709,respectively,showing that the Metarhizium species distribution in woodland i
9、s the most homogeneous.Key words:Metarhizium;entomogenous fungi;biodiversity 78 中 国 生 物 防 治 学 报 第 39 卷 绿僵菌是一种广泛存在于自然界中的病原真菌,其可在蜱类昆虫、植物根际、寄主体内及土壤中存活1。绿僵菌于 1879 年被俄国生物学家 Metschnikoff 发现并命名2。在真菌数据库中(https:/www.mycobank.org,2021.9.10 登录),绿僵菌属下共有 92 个种,现隶属真菌界 Fungi 双核亚界 Dikarya、子囊菌门 Ascomycota、盘菌亚门 Peziz
10、omycotina、粪壳菌纲 Sordariomycetes、肉座菌亚纲 Hypocreomycetidae、肉座菌目 Hypocreales和麦角菌科 Clavicipiteceae3。研究发现,绿僵菌可以寄生 8 个目 42 个科 200 多种昆虫,还能寄生螨类及线虫等4。绿僵菌可以分泌绿僵菌素,其作用机制独特,生物活性多样,具有较强的杀虫活性,对鳞翅目、半翅目、鞘翅目等 20 多种昆虫具有毒杀作用。目前,绿僵菌已成功应用于农林和卫生害虫的防治,具有较强的致病力,防治效果好,且对人畜和生态环境安全5,可以作为一种绿色安全的生物源农药用来替代化学杀虫剂,逐渐成为农业防治的重要研究内容,因其具
11、有较高的潜在经济价值和生态价值,引起了植物保护学、药物学等领域科学工作者的研究兴趣,极具发展前景。近 20 年来,绿僵菌的相关研究在我国得到快速的发展,目前与绿僵菌相关的文献已有上千篇,在中国农药信息网中,已登记的绿僵菌相关农药有16 种。因此,正确了解绿僵菌物种多样性及其分布对绿僵菌杀虫剂的研制、开发和环境的绿色保护与可持续发展具有重要的意义。1986 年,我国学者郭好礼等6报道了三个新种,分别是柱孢绿僵菌 M.cylindrosporae、贵州绿僵菌 M.guizhouense 和平沙绿僵菌 M.pingshaense。1989 年,刘爱英等7发现了新种双型孢绿僵菌 M.biformisp
12、orae,其可产两种孢子,被认为是柱孢绿僵菌的延伸。1991 年,梁宗琦等8首次报道确定发现戴氏虫草的无性型并命名为戴氏绿僵菌 M.taii,十年后,Liu 等9发现 C.brittle-bankisodes 虫草的无性型也属于绿僵菌。2004年,黄勃等10为柱孢绿僵菌和绿色野村菌 Nomuraea viridula 的正确归属提供了新的分子依据。2005 年,Huang 等11扩增并测定分析了贵州绿僵菌、戴氏绿僵菌和平沙绿僵菌的 ITS 序列,认为三者应归于金龟子绿僵菌中,同时否定了周素芬等12将从梨虎幼虫尸体分离出的黄绿绿僵菌变种认定为翠绿绿僵菌 M.iadini新种。2009 年,Bis
13、choff 等13支持 Liu 等14在 2002 年提出的戴氏绿僵菌应和贵州绿僵菌归为同一个种。我国国土面积辽阔,虫生真菌资源丰富,但是其相关研究较少,关于其资源分布等研究更为匮乏,虫生真菌资源亟待进一步了解和开发。本试验在广东、广西、福建、贵州、云南、四川、西藏、湖北、湖南、海南、河北、河南和天津共 13个省份采集了不同环境条件的土壤样品,分离纯化绿僵菌菌株,用形态学、分子生物学、ITS 序列等方法鉴定菌株,并用 ML 法构建基于绿僵菌菌株 ITS1 和 ITS4 序列的系统发育树进行系统发育分析,确定其正确的分类地位,并对该 13 个省份的绿僵菌属真菌的物种多样性进行分析。本试验对了解我
14、国土壤中绿僵菌种群结构以及为在全国范围内对分离土壤中绿僵菌自然保护区的选取提供了重要的依据,对绿僵菌杀虫剂的研制开发具有一定的推动作用。1 材料与方法 1.1 样品的采集 从广东、广西、福建、贵州、云南、四川、西藏、湖北、湖南、海南、河北、河南和天津采集不同环境条件的土壤样品。采集地表下 1520 cm 处土样各 100 g,用自封袋将土样封装,4 保存,每处采集点分 3 处采集,记录每份样品采集地点、生境、经纬度。1.2 绿僵菌菌株的分离纯化 1.2.1 土壤样品前处理 将采集的土壤样品充分碾碎,通过 0.45 mm 孔径的筛子筛出细土,每份土壤样品取 3 份 10 g 细土于 250 mL
15、 三角瓶中,倒入 100 mL 体积分数为 0.1%的吐温-80 溶液制备成土壤悬浮液,充分漩涡,静置 15 min。剩余细土样品 4 保存备用。1.2.2 绿僵菌菌株分离纯化 在无菌工作台上,用移液枪分别吸取 0.1 mL 土壤悬浮液,均匀涂布于孟加拉红分离培养基上。(251)恒温培养 4872 h 后,及时用接种环挑取单菌落,接种至孟加拉红培养基上进行纯化培养,不断重复,直至纯培养菌株,接种到斜面试管,于 4 冰箱中保藏待用15。1.3 菌种鉴定 1.3.1 形态学鉴定 在超净工作台上,用接种环挑去适量菌丝在 PDA 培养基上平行划线后,(251)第 1 期 殷旭昱等:我国部分地区土壤中绿
16、僵菌的物种多样性 79 恒温培养 310 d,待平板上长满菌丝,挑去适量菌丝制成切片,通过光学显微镜观察菌丝分支情况,孢子大小、形态特征等,并拍照记录,根据昆虫真菌学16进行形态鉴定。1.3.2 分子生物学鉴定 在无菌工作台上用OMEGA真菌抽提试剂盒提取菌株DNA。以真菌DNA为模板,以真菌通用引物 ITS1(5-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3)和 ITS4(5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3)对菌株 rDNA-ITS 区域进行 PCR 扩增17。反应体系为:94 预变性 3 min;94 变性 30 s,55 退火30 s,72 延伸 1 min,共 33 个循环
17、;72 延伸 10 min。PCR 产物送擎科生物公司测序,将扩增所得到的 ITS 序列在 NCBI 网站上进行 BLAST 相似性比对,与形态学分析结合,最终确定菌株分类地位。1.3.3 系统发育树构建 在 MEGA 7 软件中,将 No.of Bootstrap Replications 设定为 1000,依据邻接法(NJ)构建基于绿僵菌菌株 ITS1 和 ITS4 序列的系统发育树,确定其分类地位,并进行同源性比对。1.4 多样性分析 将分离得到的绿僵菌属下不同种的菌株进行统计,采用多样性指数(Shannon-Wiener 指数,H)、均匀度指数(Pielou 指数,J)、优势度指数(B
18、erger-Parker 指数,d)分析我国土壤中绿僵菌多样性。H(Pi)(lnPi),JH/Hmax,HmaxlnS,dnmax/N。式中,Pi为物种 i 的个体数占群落总个体数的比例,S 为物种数,ni为物种 i 的个体数;Hmax为 H 的最大理论值,N 为群落物种个体总数,nmax为群落中最大物种的个体数。2 结果与分析 2.1 土壤中绿僵菌属的多样性 虫生真菌的分离鉴定结果表明,这些菌株分属于绿僵菌属的4个种,分别是金龟子绿僵菌M.anisopliae、罗伯茨绿僵菌 M.robertsii、马昆德绿僵菌 M.marquandii 和黄绿绿僵菌 M.flavoviride。菌株的产孢结
19、构及孢子形态如图 1 所示,菌落特征和分生孢子大小如表 1 所示。a:金龟子绿僵菌 Metarhizium anisopliae;b:罗伯茨绿僵菌 Metarhizium robertsii;c:马昆德绿僵菌 Metarhizium marquandii;d:黄绿绿僵菌 Metarhizium flavoviride 图 1 绿僵菌菌株的产孢结构及孢子形态 Fig.1 Sporulation structure and spore morphology of Metarhizium 表 1 几种绿僵菌形态特征 Table 1 Morphological characteristics of M
20、etarhizium species 菌落 Colony of bacteria 分生孢子 Conidia 菌种 Species 形态 Form 颜色 Colour 形状 Shape 长宽 Lengthwidth(m2)金龟子绿僵菌 M.anisopliae 暗绿色棉絮状 黄绿色 短棒状(6.00.5)(2.00.5)罗伯茨绿僵菌 M.robertsii 中间暗绿色边缘白色颗粒状 浅黄色 短棒状(4.50.5)(2.00.5)黄绿绿僵菌 M.flavoviride 绿色绒毛状 黄绿色 短棒状(4.00.5)(2.00.5)马昆德绿僵菌 M.marquandii 淡紫色绒毛状 浅黄色 圆形(2.
21、00.5)(2.00.5)对 222 株绿僵菌构建系统发育树得到 Original Tree,且其 Bootstrap concensus tree 中节点数值绝大部分大于 70%,极个别处于 50%70%,说明系统发育树构建结果可信。结果显示分离纯化得到的菌株中金龟子绿僵菌 130 株、马昆德绿僵菌 83 株、黄绿绿僵菌 7 株、罗伯茨绿僵菌 2 株。80 中 国 生 物 防 治 学 报 第 39 卷 2.2 绿僵菌多样性分析 从土壤中共分离得到绿僵菌属菌株 222 株,其中金龟子绿僵菌数量最多(130 株)、马昆德绿僵菌 83株、黄绿绿僵菌 7 株、罗伯茨绿僵菌 2 株。结果表明金龟子绿僵
22、菌为所分离绿僵菌属中优势菌株,占数量的 58.56%,马昆德绿僵菌次之,占总数量 37.39%,罗伯茨绿僵菌占 0.90%,黄绿绿僵菌占 3.15%。香农-威纳指数(H)为 0.681,均匀度指数(J)为 0.494,不同生境绿僵菌多样性指数如表 2 所示。5 种不同生境情况下,休耕地、耕地、果园、草地和林地的优势度指数分别为 0.833、0.590、0.571、0.597 和 0.544。休耕地、耕地、果园、草地和林地的香农-威纳指数分别为 0.451、0.677、0.683、0.843 和0.983,说明林地的物种丰富度最高。休耕地、耕地、果园、草地和林地的均匀度指数分别为 0.325、0
23、.488、0.493、0.608 和 0.709,说明林地的绿僵菌菌种间分配最均匀。表 2 不同生境绿僵菌多样性指数 Table 2 Diversity index of Metarhizium in different habitats 多样性指数 Diversity index 休耕地 Fallow land 耕地 Farmland 果园 Orchard 草地 Grassland 林地 Woodland 优势度指数(d)Berger-Parker 0.833 0.590 0.571 0.597 0.544 香农-威纳指数(H)Shannon-Weiner 0.451 0.677 0.683
24、 0.843 0.983 均匀度指数(J)Pielou 0.325 0.488 0.493 0.608 0.709 2.3 绿僵菌属的生境分布特征 对绿僵菌的生长环境进行分析,在东经(89.47118.69),北纬(19.1241.59)分离得到这些绿僵菌,四川、河南、广西地区分离出来的绿僵菌数量高于其他省份地区(表 3)。据统计得出绿僵菌在不同生境中的分布率如图 2 所示,可以看出草地、林地和耕地更有利于绿僵菌的生长。30%35%6%26%3%草地 Grass land耕地 Farm land果园 Orchard林地 Wood land休耕地 Fallow land 图 2 绿僵菌的生境分布
25、特征 Fig.2 Habitat distribution characteristics of Metarhizium 3 讨论 随着社会经济的快速发展,人类活动对自然的影响越来越大,加之近几年我国气候不断变化,各地自然灾害层出不穷,极端环境状况时有发生,导致许多物种生境发生了较大变化,环境保护、绿色健康发展变得越来越重要,生物防治也受到广泛关注。作为一种重要的生防资源,昆虫病原真菌也是生态系统的重要组成部分,了解和保护昆虫病原真菌资源有利于人与自然和谐相处。绿僵菌作为一种优秀的生物防治材料,生效范围广,作用机制独特,生物活性多样,且对人畜和生态环境绿色安全。近年来,以绿僵菌为生物防治材料的
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