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消瘀散新组方修复膝骨关节炎...软骨损伤及MMP-13表达_崔若琳.pdf
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1、实验动物与比较医学 Laboratory Animal and Comparative MedicineFeb.2023,43(1)DOI:10.12300/j.issn.1674-5817.2022.099消瘀散新组方修复膝骨关节炎模型兔的软骨损伤及MMP-13表达崔若琳1,王 庆2,杨 玲3,冯文昌4,刘智伟1,滕蔚然1,马碧涛1,王乐杨1,秦丽萍1,金立伦1(1.上海交通大学医学院附属新华医院中医科,上海 200092;2.复旦大学附属华山医院中医科,上海 200040;3.同济大学附属上海市第四人民医院老年科,上海 200081;4.湖北省中西医结合医院科教部,武汉 430015)摘要
2、 目的研究消瘀散新组方对膝骨关节炎(knee osteoarthritis,KOA)兔关节软骨的作用及机制。方法将42只6月龄普通级新西兰白兔随机分为正常组、模型组、消瘀散组、消瘀散新组方组,每组10只(另2只用于模型验证)。除正常组外,其他各组兔均按照改良Hulth法对右侧膝关节进行KOA造模。造模5周后,对消瘀散组、消瘀散新组方组动物分别给予相应的贴膏进行膝关节炎治疗,每天1次,每次持续10 h。连续给药治疗2周后,取4组兔膝关节软骨,行大体观察并采用Outerbridge分级法评价各组软骨损伤情况,采用HE染色法在光学显微镜下观察各组兔膝关节软骨、钙化层和软骨下骨病理改变,并采用Mank
3、ins法评价软骨退变程度,采用免疫组织化学法在光学显微镜下观察各组兔膝关节软骨组织中基质金属蛋白酶13(matrix metalloproteinase-13,MMP-13)的表达情况。结果关节软骨大体观察后Outerbridge评级比较发现,消瘀散组较模型组的高分级动物数减少(P0.05),消瘀散新组方组比消瘀散组的高分级动物数也减少(P0.05)。HE染色发现4组兔关节软骨的Mankins评分由高到低依次为模型组(10.821.76)、消瘀散组(6.191.23)、消瘀散新组方组(2.641.18)和对照组(0.280.17),各组间差异有统计学意义(P0.05)。免疫组织化学检测发现各组
4、兔关节软骨组织中MMP-13表达阳性率由高到低依次为模型组(67.9013.94)%、消瘀散组(37.1019.16)%、消瘀散新组方组(13.603.10)%和对照组(3.202.39)%,各组间差异有统计学意义(P0.05)。结论消瘀散新组方可修复KOA兔关节软骨损伤,降低软骨组织中MMP-13的表达水平,这可能是其治疗骨关节炎的作用机制之一。关键词 消瘀散新组方;膝骨关节炎;关节软骨;基质金属蛋白酶-13中图分类号 Q95-33;R-332 文献标志码 A 文章编号 1674-5817(2023)01-0030-09Repair Effects of Xiaoyusan New Form
5、ula on Cartilage Injury and MMP-13 Expression in Knee Osteoarthritis Model RabbitsCUI Ruolin1,WANG Qing2,YANG Ling3,FENG Wenchang4 LIU Zhiwei1,TENG Weiran1,MA Bitao1,WANG Leyang1,QIN Liping1,JIN Lilun1(1.Xinhua Hospital Affiliated to Shanghai Jiao Tong University School of Medicine Traditional Chine
6、se Medicine Department,Shanghai 200092,China;2.Huashan Hospital Affiliated to Fudan University Traditional Chinese Medicine Department,Shanghai 200040,China;3.Department of Geriatrics,Fourth Peoples Hospital of Shanghai,Tongji University,Shanghai 200081,China;4.Hubei Hospital of Integrated Tradition
7、al Chinese and Western Medicine Department of Education and Science,Wuhan 430015,China)Correspondence to:JIN Lilun(ORCID:0000-0001-9840-836X),E-mail:ABSTRACT ObjectiveTo study the effect of Xiaoyusan new formula on the articular cartilage of knee osteoarthritis(KOA)rabbits and its mechanism.MethodsA
8、 total of 42 New Zealand white rabbits aged 6 months were randomly divided into normal group,model group,ointment of Xiaoyusan group,and ointment of Xiaoyusan new formula group,with 10 rabbits in each group(the other 2 rabbits were used for 人类疾病动物模型:药学专题 Animal Model of Human Disease:Pharmacology基金项
9、目 上海市科学技术委员会科研计划项目“消瘀散新组方治疗KOA的临床规范化研究”(19401932000);上海市进一步加快中医药传承创新发展三年行动计划项目“北部区域中医骨关节病专病联盟建设”ZY(2021-2023)-03-02-25 第一作者 崔若琳(1992),女,硕士,主治医师,研究方向:膝骨关节炎的发病机制与中药干预。E-mail:通信作者 金立伦(1967),男,硕士,主任医师,研究方向:膝骨关节炎的发病机制与中药干预。E-mail:。ORCID:0000-0001-9840-836X30实验动物与比较医学 Laboratory Animal and Comparative Med
10、icineFeb.2023,43(1)model validation).Except for the normal group,the right knee joints of all rabbits in the other groups were prepared as KOA models according to the modified Hulth method.After 5 weeks of molding,the rabbits in ointment of Xiaoyusan group,ointment of Xiaoyusan New Formula group wer
11、e given corresponding ointments for knee arthritis treatment,once a day,each time for 10 hours.After 2-week continuous administration and treatment,the knee joint cartilage of the four groups of rabbits was taken and the cartilage damage of each group was evaluated by Outerbridge grading method.The
12、pathological changes of the cartilage,calcified layer and subchondral bone of the knee joint of rabbits in each group were observed by HE staining method under the light microscope,and the degree of cartilage degeneration was evaluated by Mankins method.The expression of matrix metalloproteinase-13(
13、MMP-13)in the cartilage of rabbit knee joint in each group was deteced by immunohistochemistry.Results After the general observation of articular cartilage,the Outerbridge grading showed that the number of high-grade animals in ointment of Xiaoyusan group was reduced compared with the model group(P0
14、.05),and the number of high-grade animals in ointment of Xiaoyusan new formula group was also reduced(P0.05)compared with ointment of Xiaoyusan group.HE staining showed that Mankins scores of articular cartilage in the four groups ranked from high to low:model group(10.821.76),ointment of Xiaoyusan
15、group(6.191.23),ointment of Xiaoyusan new formula group(2.641.18)and normal group(0.280.17).The difference among four groups was statistically significant(P0.05).Immunohistochemical detection showed that the positive rates of MMP-13 expression in rabbit articular cartilage tissues in each group were
16、(67.9013.94)%of model group,(37.1019.16)%of ointment of Xiaoyusan group,(13.603.10)%of ointment of Xiaoyusan new formula group and(3.202.39)%of normal group,ranking from high to low,and the difference among four groups was statistically significant(P0.05).Conclusion Xiaoyusan new formula can repair
17、articular cartilage degeneration in KOA rabbits and decrease the expression of MMP-13 in cartilage,which may be one of the mechanisms of the treatment.Key words Xiaoyusan new formula;Knee osteoarthritis;Articular cartilage;Matrix metalloproteinase-13膝骨关节炎(knee osteoarthritis,KOA)是一种慢性退变性疾病,以软骨的退行性病变
18、、软骨下骨硬化、滑膜炎等导致的膝关节功能丧失为主要特征,发病机制复杂。目前对KOA的阶梯治疗方案分为四类:基础治疗、药物治疗、修复治疗和重建治疗。但是上述保守治疗方法(包括基础治疗及药物治疗)并不能抑制逐日加剧的关节软骨退行性改变,长期服用药物还会引起胃肠反应、消化管溃疡及出血等不良反应。从中医理论角度出发,KOA的病因主要是风寒湿等外感邪气,同时该病的发生也有内在因素,包括年老体虚、肝肾亏损、筋骨失养等机体肝肾气血不足。内经中提到“男子七八,肝气衰,筋不能动;八八,天癸竭,精少,肾脏衰,形体皆极”,表明随着人体年龄的增长,肝肾功能及气血津液逐渐衰少,肢体各方面活动能力下降,外加生活不规律、不
19、注重饮食等情况,导致虚弱的中老年人体质更加容易感受风寒湿邪,从而导致痹症。因此,本病也称为老年性骨关节炎,发病人群主要集中在中老年群体。临床研究中也发现KOA患者的年龄普遍较大。基于此临床认识及“本虚标实”的病机1,“缓则治其本”,针对KOA的治疗当以补益肝肾、温阳通络、活血化瘀为治则。新华医院中医骨伤科是魏氏伤科的传承分基地,消瘀散贴膏方及其精简方是魏氏伤科的经验方。前期研究表明:临床上,消瘀散在治疗踝关节软组织损伤和KOA时均有较好的治疗效果2-6;动物实验提示消瘀散能够降低大鼠KOA模型软骨中血管内皮生长因子的表达7-8,从而起到治疗KOA的作用。后经过临床实践与大量文献查阅,发现在补益
20、肝肾中药中,附子、杜仲、淫羊藿的使用居多,在前期研究基础上向消瘀散精简方中加入三味补肝肾活血药附子、杜仲、淫羊藿,组成消瘀散新组方。消瘀散原方中以活血化瘀药为主要成分,新加的三味药以补益肝肾、温阳通络为主要作用,方药、治则与病机相呼应。但消瘀散新组方对KOA治疗的作用机制尚不清楚。为了便于药物机制研究及质量控制,本研究拟从观察消瘀散新组方对兔KOA关节软骨的影响入手,验证消瘀散新组方对KOA的治疗效果。另外,关节软骨的退变是KOA发生的重要机制之一,而且基质金属蛋白酶(matrix 31实验动物与比较医学 Laboratory Animal and Comparative MedicineFe
21、b.2023,43(1)metalloproteinases,MMPs)是导致软骨基质降解的一个重要因子,尤其MMP-13是关节软骨退变的标志物之一9。本研究将MMP-13作为切入点,探索消瘀散新组方治疗KOA的作用机制。1材料与方法1.1实验动物6月龄普通级新西兰白兔42只,雌雄各半,体质量(2.30.5)kg,购自瑞特培斯生物科技启东有限公司 SCXK(苏)2019-0003,质量合格证编号为202103933。实验兔饲养于上海交通大学医学院附属新华医院动物实验中心SYXK(沪)2018-0038,标准实验室条件下喂养,饮普通饮用水。本研究获得上海交通大学医学院附属新华医院医学伦理委员会审
22、查批准(XHEC-F-2022-061)。1.2中药方膏的配制消瘀散方:蒲公英250 g,乳香100 g,没药100 g,川大黄100 g,地鳖虫100 g,蒲黄100 g,五灵脂330 g,苏木屑52 g,三七100 g,刘寄奴150 g,西泽兰150 g,紫丹参 165 g,川当归 150 g,老鹳草 165 g,紫荆皮165 g。消瘀散新组方:川大黄 100 g,紫荆皮 165 g,乳香100 g,三七100 g,当归150 g,附子100 g,杜仲100 g,淫羊藿100 g。两方均由上海虹桥饮片厂统一配成药粉,以1 kg800 mL的比例加入生理盐水后搅拌均匀,使药物和0.9%NaC
23、l溶液(即生理盐水)相互渗透。20 min后,以13.5的质量比,将中药放入麦芽糖中充分搅拌10 min至黏稠状,即为可使用的药膏。将药膏装入密封罐,置于4 冰箱冷藏备用,每张贴膏50 g。1.3主要试剂苏木素-伊红染液(货号G1004)、EDTA(pH 8.0)抗原修复液(货号RC016)、PBS缓冲液(RC035)等均购自上海茹创生物科技有限公司;牛血清蛋白(bovine serum albumin,BSA)(货号A8020)购自北京索莱宝科技有限公司;兔抗人MMP-13一抗(工作液体积稀释比例为12 000)购自英国Abcam公司的兔抗人多克隆抗体,辣根过氧化物酶(horse radis
24、h peroxidase,HRP)标记的山羊抗兔/鼠通用二抗和免疫组织化学试剂盒DAB显色剂购自丹麦DAKO公司。青霉素(批号H37020079)购自山东鲁抗医药股份有限公司,速眠新注射液购自吉林省敦化市圣达动物药品有限公司。1.4主要仪器微量移液器(德国 Eppendorf 公司);80 和20 冰箱(美国Thermo公司);4 冰箱(日本Sanyo公司);倒置显微镜(日本Olympus公司);超速离心机(美国LI-COR Biosciences);电子天平(上海分析仪厂);外科手术器械(张家港市大都医疗器械有限公司);KA-1000台式离心机(上海安亭科学仪器厂);恒温水浴箱(上海精宏实验
25、设备有限公司)。1.5动物造模与分组干预将42只成年新西兰白兔按照随机数字表法,随机分为正常组(A 组)、模型组(B 组)、消瘀散组(C组,作为阳性对照)和消瘀散新组方组(D组),每组10只,2只用作模型验证。除正常组外,其余所有动物均按照改良Hulth法10进行单侧KOA造模:通过缘静脉注射3%戊巴比妥钠(1 mL/kg)麻醉动物后,取兔右侧膝关节内侧入路,切断内侧副韧带,摘除内侧半月板,切断前交叉韧带;术后连续3 d青霉素2105 U/kg肌内注射,1周后开始每天强迫兔活动0.5 h,连续7周。正常组给予相同的切皮,但不伤及膝关节,术后常规肌内注射青霉素预防感染,每天2105 U/kg,连
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