线粒体转录因子A在炎症相关...的发生和进展阶段的双向作用_杨世荣.pdf
《线粒体转录因子A在炎症相关...的发生和进展阶段的双向作用_杨世荣.pdf》由会员分享,可在线阅读,更多相关《线粒体转录因子A在炎症相关...的发生和进展阶段的双向作用_杨世荣.pdf(20页珍藏版)》请在咨信网上搜索。
1、530癌 症 2 0 2 2年 第 4 1卷 第 1 1期*通讯作者:邢金良,;黄启超, 杨世荣和何显力对本文贡献相同1 空军军医大学肿瘤生物学国家重点实验室/空军军医大学基础医学院生理与病理生理教研室,空军军医大学,西安 710032,陕西,译作已获得版权所有者许可线粒体转录因子A在炎症相关结直肠癌的发生和进展阶段的双向作用杨世荣1,2,何显力2,赵静1,王大林3,郭珊珊1,高天2,王刚1,金超2,闫泽宇2,王楠2,王永兴4,赵诣林1,邢金良1,黄启超1原创论著中国;2 普外科,空军军医大学唐都医院,西安 710032,陕西,中国;3 肝胆外科,空军军医大学西京医院,西安 710032,陕西
2、,中国;4 呼吸内科,空军军医大学西京医院,西安 710032,陕西,中国原文链接:hfips:/doi.org/10.1002/cac2.12184【摘要】背景与目的 线粒体是细胞增殖和凋亡的关键调节因子。线粒体功能的改变与炎症和肿瘤发生密切相关。线粒体转录因子A(mitochondrial transcription factor A,TFAM)是线粒体DNA转录和复制的重要调节因子,本文旨在研究其是否参与炎症相关结直肠癌(colitis-associated cancer,CAC)的发生和进展。方法 通过免疫组织化学法检测炎性肠病(inflammatory bowel diseases,
3、IBD)和CAC组织样本中TFAM的表达情况。用肠上皮细胞(intestinal epithelial cell,IEC)TFAM特异性敲除小鼠(TFAMIEC)和TFAM敲低或过表达的结直肠癌(colorectal cancer,CRC)细胞评估TFAM在肠炎及CAC的发生和进展中的作用。通过分析线粒体呼吸功能和生物发生探讨TFAM的潜在作用机制。结果 TFAM在人活动性IBD中表达下调,与疾病活动度呈负相关。在IEC中IL-6通过调控信号转导和转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)/miR-23b通
4、路轴下调TFAM表达。此外,TFAM敲除可影响IEC再生,从而加剧葡聚糖硫酸钠(dextran sulfate sodium,DSS)诱导的小鼠肠炎症状。值得注意的是,TFAM敲除可促进偶氮甲烷/DSS诱导的小鼠CAC的发生,TFAM过表达可抑制模型小鼠肠炎和炎症相关结直肠癌的发生。TFAM在CAC组织中表达上调并促进细胞生长。在CRC细胞中-连环蛋白通过调控c-Myc促进TFAM表达上调。在机制上,TFAM通过增加线粒体的生物发生和活性来促进IEC和CRC细胞增殖。结论 TFAM在CAC的发生和进展的不同阶段发挥不同的作用,为CAC发病机制的研究提供了新数据。【关键词】肠炎;结肠炎症相关结直
5、肠癌;结直肠癌;能量代谢;炎性肠病;肠道稳态;线粒体转录因子A(mitochondrial transcription factor A,TFAM)炎性肠病(inflammatory bowel diseases,IBD)包括溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)和克罗恩病(Crohns disease,CD),其特征为肠炎反复发作。IBD患者发生结直肠癌(colorectal cancer,CRC)的风险增加1,UC2和CD3患者发生CRC的风险分别是一般人群的30倍和5.6倍。此外,与531癌 症 2 0 2 2年 第 4 1 卷 第 1 1期散发性CRC患者相比,炎症
6、相关结直肠癌(colitis-associated cancer,CAC)患者更年轻,常伴有多个癌灶,并且在确诊时大多已为晚期4。IBD患者发生CAC的主要因素可能与炎症的严重程度和持续时间相关,但对CAC的发病机制仍知之甚少。在肠道内,维持肠道上皮细胞更新对于保证肠道中共生微生物群和食物消化的有效屏障功能非常重要。然而,IBD患者的肠上皮屏障常常被破坏,这与肠上皮细胞增殖减少和细胞死亡增加有关,进而促进炎症向癌症转变5,6。那么,在炎症条件下抑制细胞增殖以及在肿瘤阶段促进细胞增殖的关键因素是什么呢?线粒体是半自主细胞器,含有自身的线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)
7、,该DNA编码呼吸链的13种必需蛋白质。在肿瘤发生过程中,线粒体在调节细胞增殖和凋亡中发挥关键作用7。最近的一些研究8表明,线粒体的内在动态在炎症信号传导过程中起着至关重要的作用。同样,炎症介质也可能改变线粒体功能。例如,Haberman等9和Reifen等10发现在活动期UC患者体内线粒体和核编码线粒体基因显著减少,在肠炎大鼠模型中也观察到此现象。同时,在CD患者肠上皮细胞(intestinal epithelial cell,IEC)中线粒体超微结构发生显著改变(例如线粒体嵴溶解/不规则),表明线粒体功能受损,这是炎症的早期事件11。我们之前的研究12和其他研究13,14表明,人散发性CR
8、C组织中的线粒体质量和mtDNA含量显著高于正常结肠黏膜。此外,有研究15,16显示,CRC细胞将线粒体氧化磷酸化作为其主要的能量来源。然而,线粒体是否以及如何参与肠炎和CAC的调控尚不清楚。由 核 基 因 编 码 的 线 粒 体 转 录 因 子 A(mitochondrial transcription factor A,TFAM)在编码电子传递链关键组分的mtDNA的转录17和复制18中发挥重要作用,TFAM是通过氧化磷酸化产生能量的重要转录因子19。TFAM功能失活可导致线粒体增大、嵴异常、能量产生减少和胚胎死亡20。脂肪细胞特异性缺失TFAM可促进线粒体氧化,抑制小鼠肥胖和胰岛素抵抗2
9、1。此外,TFAM的截短突变可在微卫星不稳定的CRC中诱导mtDNA缺乏和细胞凋亡抵抗22。然而,在肠炎和CAC中进行TFAM基因中断的研究尚未见报道。本文使用IEC特异TFAM基因敲除小鼠来研究TFAM在肠炎和CAC发生和进展过程中的作用。我们还分析了TFAM在人肠炎和CAC组织中的表达情况,并利用正常人结直肠上皮细胞系和CRC细胞系在体外探讨了TFAM潜在的作用机制。1 材料和方法1.1 试剂人肿瘤坏死因子-(human tumor necrosis factor-,TNF-)(货号:30001A)和白细胞介素-6(nterleukin-6,IL-6;货号:200-06)购自PeproTe
10、ch公司(Rocky Hill,NJ,USA)。microRNA(miRNA/miR)模拟物和抑制剂由上海GenePhama公司(上海,中国)合成,序列见补充表S1。寡霉素(货号:495455)、偶氮甲烷(azoxymethane,AOM;货号:A5486)和异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)-葡聚糖(货号:46944)购自Merck公司(St.Louis,MO,USA)。硫酸葡聚糖钠(dextran sulfate sodium,DSS;货号:0216011080)购自MP生物医疗公司(Irvine,CA,USA)。信号转导和转录激活因子3(si
11、gnal transducer and activator of transcription 3,STAT3)抑制剂Stattic(货号:S7024)、-连环蛋白抑制剂IWR-1(货号:HY-12238)和KYA1797K(货号:HY-101090)、-连环蛋白激动剂SKL2001(货号:HY-101085)和IM-12(货号:HY-12292)购自MedChemExpress(Monmouth Junction,NJ,USA)。青霉素链霉素溶液(货号:P1410)、琼脂糖(货号:9012-36-6)和乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA,
12、货号:E8040)购自北京阳光生物科技有限公司(北京,中国)。Trizol(货号:15596-026)购自Invitrogen公司(Carlsbad,CA,USA)。嘌呤霉素购自DIYIBio公司(上海,中国)。1.2 细胞培养和患者样本收集正常人结直肠上皮细胞系FHC和CRC细胞系SW1116、T84、RKO、SW480、SW620、LoVo、CaCo2和HCT116购自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection,ATCC,Manassas,VA,USA)。正常人结直肠上皮细胞系NCM460购自Incell公司(San Antonio,TX,US
13、A)。细胞在RPMI-1640532癌 症 2 0 2 2年 第 4 1卷 第 1 1期培养基(Gibco,Thermo Fisher Scientific,Inc.,Waltham,MA,USA)或达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbeccos Modified Eagle,DMEM,Gibco,USA)中培养,添加有10%胎牛血清(Gibco)和1%青霉素/链霉素溶液。细胞培养于37C、5%CO2的湿润环境中。在蛋白质免疫印迹和逆转录定量PCR实验前,将STAT3抑制剂Stattic(20 mol/L)加入NCM460和FHC的细胞培养基中,细胞培养24 h。10例石蜡包埋的正常结肠组织作为
14、正常对照组、88例UC患者新鲜炎症组织、90例CD患者新鲜炎症组织、30例新鲜和7例石蜡包埋的CAC患者组织以及IBD患者对应的静脉血样本均收集自空军军医大学附属唐都医院和西京医院(西安,陕西,中国)。IBD患者的临床特征见补充表S2。所有参与者均签署了书面知情同意书,本研究得到FMMU伦理委员会的批准。1.3 实验动物TFAMflox/flox小鼠具有位于TFAM外显子67侧翼的LoxP位点,由聂勇战教授(空军军医大学西京医院消化科)惠赠。Villin-Cre小鼠由张健教授(空军军医大学基础医学科学院生物化学与分子生物学系)惠赠。通过将TFAMflox/flox小鼠与Villin-Cre小鼠
15、在无特定病原体(specific pathogen-free,SPF)实验动物房(实验动物中心,空军军医大学)中杂交,生成IEC特异性缺乏TFAM的小鼠模型(TFAMIEC)。通过多重PCR和琼脂糖凝胶电泳检测小鼠的基因型。在TAE缓冲液中制备含有0.5 g/mL溴化乙锭的琼脂糖凝胶(2%)。DNA样品在琼脂糖凝胶中以100 V电压分离30 min。TFAM野生型等位基因产生一段396 bp的PCR产物,而TFAM缺失等位基因产生一段438 bp的PCR产物,如文献23中所述。所有动物实验程序均获得空军军医大学动物伦理委员会的批准。1.4 建立CAC和肠炎动物模型按照文献24所述方法建立CAC
16、小鼠模型。简言之,将810周龄的TFAMIEC和野生型(wild-type,WT)同窝出生的C57BL/6J小鼠腹腔注射10 mg/kg AOM,正常饲养2 d。然后,连续5 d给小鼠喂食1.5%DSS,然后再用普通水喂养14 d,以此为一循环,重复3个循环。未经AOM/DSS处理的小鼠作为对照组。注射AOM后1个月或3个月对小鼠实施安乐死,然后纵向切开小鼠结肠。在显微镜(M205,Leica Microsystems公司,Wetzlar,德国)下计数肿瘤结节。为了建立DSS诱导的肠炎小鼠模型,连续5 d给小鼠喂食2.5%DSS,然后再换普通水喂养5 d。按照文献25,26所述方法,每天测量小
17、鼠的体重、大便稠度(0,正常;2,稀便;4,腹泻)和便血(0,潜血阴性;2,潜血阳性;4,血便)情况。在第5 d(DSS处理结束)或第10 d(DSS和正常水处理结束)引颈处死小鼠,然后测量结肠长度。将组织样品冷冻在液氮中或固定在10%福尔马林中以供后续实验。1.5 逆转录定量PCR(reverse transcription-quantitative PCR,RT-qPCR)为了明确CRC细胞中-catenin对TFAM表达的调控作用,分别将20 mol/L IWR1、20 mol/L KYA1797K、30 mol/L SKL2001或5 mol/L IM-12加入细胞培养基中与作用细胞2
18、4 h。使用Trizol从小鼠或人结肠组织、正常人结直肠上皮细胞系、CRC细胞系中提取总RNA,然后使用高容量cDNA反转录试剂盒(货号:4368814,Thermo Fisher Scientific公司,Waltham,MA,USA)逆转录为cDNA。使用TB Green Premix Ex TaqTM II(货号:RR820A;Takara Bio公司,Tokyo,Japan)在实时PCR仪(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)上进行RT-qPCR。反应条件为95C 2 min,然后95C 10 s和60C 30 s,进行40个循环。使用2-Ct法计算基因的相对表达水平。以甘
19、油醛磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-phosphate dehydrogenase,GAPDH)和U6 snRNA(仅用于miRNA)作为参考基因。使用的引物序列见补充表S1。1.6 mtDNA拷贝数检测按照文献27所述方法,使用RT-qPCR检测相对mtDNA拷贝数。使用QIAamp DNA Mini试剂盒(货号:51306;Qiagen公司,Hilden,Germany)从FHC和RKO细胞中提取基因组DNA。mtDNA中线粒体NADH脱氢酶1(mitochondrial NADH dehydrogenase 1,MT-ND1)基因与单拷贝核基因人球蛋白(human globul
20、in,HGB)的比率由标准曲线测定。使用的引物序列见补充表S1。1.7 蛋白质免疫印记(western blotting,WB)和免疫组化(immunohistochemistry,IHC)533癌 症 2 0 2 2年 第 4 1 卷 第 1 1期WB和IHC按照文献28所述方法进行。用从小鼠结肠组织、正常人结直肠上皮FHC和NCM460细胞、CRC细胞系(如SW480、HCT116、RKO)中提取蛋白质进行WB。然后使用ECL试剂盒(Thermo Fisher Scientific公司)显影。由2名病理科医生对人正常、炎症结肠组织和CAC组织的IHC染色进行独立盲检,在显微镜下对每张载玻片
21、选取5个视野(200)判断染色强度(0,无;1,淡黄色;2,黄色;3,棕色)和阳性细胞比例(0,09%;1,10%25%;2,26%50%;3,51%75%;4,76%100%)。IHC得分(范围从0到12)=阳性细胞的百分比染色强度。将TFAM表达水平划分为低表达(03分)、中度表达(47分)和高表达(812分)。研究中所使用的抗体见补充表S3。1.8 组织学分析按 照 文 献 2 9 所 述 方 法 进 行 苏 木 精 和 伊 红(hematoxylin and eosin,H&E)染色。使用文献30描述的3个独立参数进行小鼠肠炎的组织学评分:损伤程度(0,无;1,仅黏膜;2,黏膜下层;3
22、,透壁)、隐窝损伤(0,无;1,基底1/3受损;2,基底2/3受损;3,几乎整个上皮受损)和白细胞浸润严重程度(0,无;1,轻度;2,中度;3,严重)。1.9 肠道通透性检测按照文献31,32所述方法,通过检测血液中FITC-葡聚糖和D-乳酸的含量来评估肠道通透性。通过灌胃对小鼠给予FITC-葡聚糖(0.4 mg/g 体重),4 h后将小鼠处死。使用激发波长为485 nm和发射波长为535 nm的荧光酶标仪(Thermo Fisher Scientific公司)测量血清FITC-葡聚糖浓度。根据产品说明书,使用D-乳酸检测分析试剂盒(货号:GMS70095.3,Shanghai Genmed公
23、司,上海,中国)检测血清D-乳酸浓度。使用标准曲线得出的斜率和截距计算D-乳酸浓度。1.10 靶基因的敲低和过表达TFAM及其转录因子c-Myc敲低和过表达的慢病毒载体由上海吉玛制药技术有限公司(货号:D01001、D02001,上海,中国)构建。通过用慢病毒表达载体和包装质粒共转染297T细胞收集慢病毒。将正常人结直肠上皮细胞或CRC细胞(5 104/孔)接种到6孔板中,在37oC、5%CO2孵育过夜。然后用无血清培养基将慢病毒加入到每个孔中(感染复数为10),孵育过夜。用嘌呤霉素(5 g/mL)筛选转染成功的细胞克隆。WB测定慢病毒转染细胞中TFAM和c-Myc的表达水平。1.11 细胞增
24、殖测定和细胞周期分析按照文献33所述方法,使用Cell-Light 5ethynyl-2-deoxyuridine(EdU)Apollo567 In Vitro Kit(货号:C10310,Ribobio公司,广州,广东,中国)和碘化丙啶(propidium iodide,PI)染色试剂盒(货号:BB-4104,上海贝博生物科技公司)测定细胞增殖。在适当的情况下,使用2 g/mL寡霉素抑制线粒体F0F1-ATPase。EdU测定,2 105细胞与EdU共孵育2 h,然后用4%多聚甲醛固定。用Hoechst(货号:C1022,碧瑶生物技术研究所,中国上海)进行核染色。使用荧光显微镜(Olympu
25、s Corporation,Tokyo,Japan)观察和对图像拍照。细胞周期分析,收集1 106个细胞,与PI染色溶液在4C下孵育30 min,然后使用流式细胞仪(Beckman Coulter公司,CA,USA)检测细胞周期。1.12 检测线粒体呼吸链复合酶活性、耗氧率(oxygen consumption rate,OCR)和线粒体三磷酸腺苷(mitochondrial adenosine triphosphate,ATP)含量按照产品说明书,使用检测试剂盒(货号:BC0510、BC3240、BC0945和BC1445,北京阳光生物科技有限公司),通过单波长分光光度法测定细胞提取物中复合
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 线粒体 转录 因子 炎症 相关 发生 进展 阶段 双向 作用 杨世荣
1、咨信平台为文档C2C交易模式,即用户上传的文档直接被用户下载,收益归上传人(含作者)所有;本站仅是提供信息存储空间和展示预览,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对上载内容不做任何修改或编辑。所展示的作品文档包括内容和图片全部来源于网络用户和作者上传投稿,我们不确定上传用户享有完全著作权,根据《信息网络传播权保护条例》,如果侵犯了您的版权、权益或隐私,请联系我们,核实后会尽快下架及时删除,并可随时和客服了解处理情况,尊重保护知识产权我们共同努力。
2、文档的总页数、文档格式和文档大小以系统显示为准(内容中显示的页数不一定正确),网站客服只以系统显示的页数、文件格式、文档大小作为仲裁依据,平台无法对文档的真实性、完整性、权威性、准确性、专业性及其观点立场做任何保证或承诺,下载前须认真查看,确认无误后再购买,务必慎重购买;若有违法违纪将进行移交司法处理,若涉侵权平台将进行基本处罚并下架。
3、本站所有内容均由用户上传,付费前请自行鉴别,如您付费,意味着您已接受本站规则且自行承担风险,本站不进行额外附加服务,虚拟产品一经售出概不退款(未进行购买下载可退充值款),文档一经付费(服务费)、不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
4、如你看到网页展示的文档有www.zixin.com.cn水印,是因预览和防盗链等技术需要对页面进行转换压缩成图而已,我们并不对上传的文档进行任何编辑或修改,文档下载后都不会有水印标识(原文档上传前个别存留的除外),下载后原文更清晰;试题试卷类文档,如果标题没有明确说明有答案则都视为没有答案,请知晓;PPT和DOC文档可被视为“模板”,允许上传人保留章节、目录结构的情况下删减部份的内容;PDF文档不管是原文档转换或图片扫描而得,本站不作要求视为允许,下载前自行私信或留言给上传者【自信****多点】。
5、本文档所展示的图片、画像、字体、音乐的版权可能需版权方额外授权,请谨慎使用;网站提供的党政主题相关内容(国旗、国徽、党徽--等)目的在于配合国家政策宣传,仅限个人学习分享使用,禁止用于任何广告和商用目的。
6、文档遇到问题,请及时私信或留言给本站上传会员【自信****多点】,需本站解决可联系【 微信客服】、【 QQ客服】,若有其他问题请点击或扫码反馈【 服务填表】;文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“【 版权申诉】”(推荐),意见反馈和侵权处理邮箱:1219186828@qq.com;也可以拔打客服电话:4008-655-100;投诉/维权电话:4009-655-100。